СИНБИОТИК МАКСИЛАК® БЕЗОПАСЕН С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ГЕНОВ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ
Кукес Е.А., Фурсова Н.К., Слукин П.В. и др. Синбиотик Максилак® безопасен с точки зрения возможности распространения генов антибиотикорезистентности. Фармакология & Фармакотерапия. 2025; 2: 36–42. DOI 10.46393/27132129_2025_2_36–42
В статье представлено исследование, посвященное полногеномному секвенированию и характеристике полных геномов изолятов лактобактерий и бифидобактерий, выделенных из синбиотика Максилак® Бэби. Полученные в ходе исследования данные позволяют сделать вывод о безопасности выделенных из препарата Максилак® Бэби штаммов лактобактерий и бифидобактерий с точки зрения отсутствия у них факторов вирулентности, а также низкой вероятности возможности передачи генетических детерминант антибиотикорезистентности другим бактериям микробиома человека.
Введение Пробиотики – живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью пациента [1]. Большинство микроорганизмов, признанных на сегодняшний день пробиотиками, относятся к грамположительным бактериям, включая представителей родов Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus и Bifidobacterium [2]. Создана геномная база данных Integrated Probiotics Database (https://www.optibacprobiotics.com/uk/professionals/ probiotics-database), куда включены распространенные штаммы, используемые в пробиотических продуктах, для которых опубликованы последовательности геномов. Эта база данных используется для сравнительного анализа геномов с целью выявления генетических факторов, определяющих структурные, функциональные и химические особенности, важные для воздействия на организм хозяина и на другие микроорганизмы. Критериями идеального пробиотического штамма являются [3]: • устойчивость к кислоте желудка и желчи; • способность адгезии на клетках кишечного эпителия; • колонизация желудочно-кишечного тракта, продукция антимикробных веществ; • хорошие характеристики роста; • положительное влияние на здоровье человека. Использование пробиотических препаратов приобретает особенно важное значение в эпоху кризиса в медицине, связанного с лекарственной устойчивостью возбудителей инфекций человека к антимикробным препаратам. Неадекватное использование антибиотиков в течение жизни человека может привести к формированию резистентных микроорганизмов в кишечном микробиоме и опасности передачи генов антибиотикорезистентности между комменсальными и патогенными бактериями. В настоящее время резистентность бактерий к антимикробным препаратам (antimicrobial resistance, AMR) представляет растущую угрозу для мирового здравоохранения и экономики [4, 5]. Способность пробиотических бактерий влиять на многие процессы в организме хозяина диктует острую необходимость всестороннего исследования пробиотиков и стандартизации оценки их безопасности. Наибольшую актуальность в этом аспекте на сегодняшний день приобретает требование к контролю отсутствия у штаммов трансмиссивных генов, прежде всего антибиотикорезистентности. Пробиотические штаммы специально отбираются таким образом, чтобы не переносить гены AMR, при этом особое внимание уделяется детерминантам, расположенным вблизи мобильных элементов или интегрированным в бактериальные плазмиды, которые могут способствовать распространению AMR [6]. Природная резистентность пробиотических бактерий обладает минимальным потенциалом горизонтального распространения [7]. У лактобацилл описаны довольно разнообразные механизмы формирования устойчивости к антибиотикам, связанные как с модификацией мишени действия антибиотика (пассивный механизм), так и с модификацией молекул антибиотика продуцируемыми ферментами (активный механизм), а также с активацией эффлюксных насосов. Наличие эффлюксных насосов, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость, – основной механизм, ответственный за устойчивость лактобактерий к антибиотикам [8]. Например, у некоторых штаммов L. plantarum идентифицирован ABC-транспортер, кодируемый хромосомным геном lmrA, а у штаммов L. pentosus – сложные AcrAB-TolC-подобные эффлюксные системы, обеспечивающие устойчивость к различным антибиотикам, таким как бета-лактамы, хлорамфеникол, тетрациклин и др. [9]. Показано, что наличие генов резистентности соответствует фенотипическому проявлению устойчивости к данному классу антибиотиков, за исключением несоответствия фенотипической чувствительности штаммов к тетрациклину и эритромицину и наличием генов (tetK и tetL) и (ermB и mefA) соответственно. Лактобациллы преимущественно чувствительны к ингибиторам синтеза белка (тетрациклину, эритромицину, хлорамфениколу и линезолиду). Однако у некоторых штаммов, выделенных из различных источников, обнаружена приобретенная устойчивость к тетрациклину, эритромицину, хлорамфениколу и клиндамицину [10]. Как правило, лактобациллы чувствительны к бета-лактамам (пенициллину и ампициллину), что ассоциировано с отсутствием у них генов бета-лактамаз, но появились сообщения об обнаружении генов бета-лактамаз blaTEM у 80% штаммов, а генов blaSHV и blaOXA-1 – у 20 и 15% штаммов соответственно. Большинство штаммов Lactobacillus spp. обладают природной устойчивостью к аминогликозидам (гентамицину, канамицину, неомицину и стрептомицину), ванкомицину, ципрофлоксацину и триметоприму. Однако гены, кодирующие аминогликозид- модифицирующие ферменты aadA и aadE, обнаружены только у 20% тестируемых штаммов; ген vanX, ассоциированный с ванкомицин-резистентностью, – у 75% штаммов; мутации в генах gyrA и parC, обеспечивающие резистентность к фторхинолонам, – у 20% штаммов [11]. У представителей рода Bifidobacterium фенотипы устойчивости к AMR не зависят от присутствия соответствующих генов, за исключением резистентности к тетрациклинам (tet-гены). Бóльшая часть резистомов бифидобактерий ассоциирована с устойчивостью к гликопептидам (12%) и бета-лактамам (10%). Представленность генов AMR у бифидобактерий может быть обусловлена селективным воздействием, вызванным широким применением антибиотиков у организмов- хозяев этих бактерий, у животных и человека, – явлением, которое считается примером коэволюции микро- и макроорганизмов. Анализ in silico показал, что только незначительная часть идентифицированных генов AMR (1%) расположена рядом с мобильными генетическими элементами – профагами или транспозонами [12]. В то же время наличие AMR может рассматриваться не как отрицательное, а как полезное свойство пробиотического препарата, так как оно может повысить выживаемость штамма пробиотика в микробиоме человека в ходе антимикробной терапии [13]. Большой вклад в изучение проблемы наличия генов AMR в пробиотических препаратах и возможности их горизонтального переноса другим бактериям микробиома внес метод высокопроизводительного метагеномного анализа, который в настоящее время выступает мощной альтернативой лабораторным анализам [14]. Технологии анализа бактериальных геномов с использованием полногеномного секвенирования получили широкое распространение в научно-практической работе, поскольку они позволяют не только обнаруживать гены, ответственные за изменение фенотипических и клинических свойств штаммов бактерий, но и выявлять новые, атипичные штаммы. Эти технологии лежат в основе сформулированного недавно подхода «пробиогеномика» для подробного изучения и характеристики пробиотических препаратов [15]. Целью исследования было проведение полногеномного секвенирования и анализ геномов пробиотических штаммов лактобактерий и бифидобактерий, входящих в состав синбиотика Максилак® Бэби, на наличие генетических детерминант антибиотикорезистентности. Материал и методы Исследование проведено при неукоснительном соблюдении требований Санитарных правил СП 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», а также Методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности ». Препарат Максилак® Бэби (Labomar S.p.A, Италия) – синбиотик, в состав которого входят 1 × 109 КОЕ/дозу клеток каждого из 6 штаммов лактобактерий (L. acidophilus LA-14, L. casei LC-11, L. paracasei Lpc- 37, L. plantarum Lp-115, L. rhamnosus GG и L. salivarius Ls-33) и 3 штаммов бифидобактерий (B. lactis Bl-04, B. bifidum Bb-02 и B. longum Bl-05). Культивирование лактобактерий и бифидобактерий осуществляли на плотных питательных средах «Лактобакагар», «Бифидум-среда» (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск, Россия) в анаэростате с 5% CO2 в течение 24 часов. Идентификацию микроорганизмов осуществляли с помощью прибора MALDITOF Biotyper (Bruker, Германия). Чувствительность к антимикробным препаратам амоксициллину, цефиксиму, цефуроксиму, канамицину, азитромицину, кларитромицину, джозамицину, тигециклину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, триметоприму, ванкомицину и линезолиду определяли согласно рекомендациям Европейского агентства по безопасности пищевых продуктов (European Food Safety Authority, EFSA) [16], Методическим указаниям МУ 2.3.2.2789-10 [17] и Клиническим рекомендациям Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ) «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (2021) [18]. Выделение бактериальной ДНК проводили CTAB-методом [19]. Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе Genolab M (GeneMind Biosciences, Китай) с использованием набора SG GM (Raissol Bio, Россия), согласно рекомендациям производителей. Для сборки геномов использовали программу Unicycler (https://github.com/rrwick/Unicycler.git). Оценку качества сборки геномов, верификацию видовой идентификации, MLST-типирование, филогенетический анализ, выявление генов антибиотикорезистентности, вирулентности и мобильных генетических элементов, наличия плазмид и систем рестрикции-модификации проводили с помощью веб-ресурсов fIDBAC (http://fbac.dmicrobe.cn/tools/), Центра геномной эпидемиологии (https://cge.food.dtu.dk/services) и Института Пастера, Париж (https://bigsdb.pasteur. fr/bifidobacterium/). Для анализа данных метагеномного анализа использовали программное обеспечение Kraken Metagenomics version 2 (https://ccb.jhu.edu/ software/kraken2/). Результаты и обсуждение В ходе исследования на основании выделения и идентификации чистых культур показано, что синбиотик Максилак® Бэби соответствует заявленному составу как по количеству штаммов, так и по содержанию живых клеток, что подтверждено также метагеномным анализом препарата [20]. Полногеномное секвенирование изолятов 6 штаммов лактобактерий и 3 штаммов бифидобактерий, выделенных из данного препарата, показало их идентичность с референс-геномами из базы данных GenBank на уровне 97,68–100% совпадения (табл. 1). Филогенетический анализ изучаемых геномов лактобактерий и бифидобактерий (fIDBAC) выявил родство с геномами соответствующих видов пробиотиков, размещенными в базе данных GenBank: L. paracasei UCD174 (NZ_AFYQ00000000.1, США, 2012), Lbs2 (JPKN03000228.1, Индия, 2019), W14 (NZ_MWVE00000000.1, Гонконг, 2023), HZ-1 (NZ_MOAG00000000.1, Китай, 2024) и Lpp120 (ANMK00000000.1, Франция, 2012); L. rhamnosus ATCC53103 (FM179322, Финляндия, 2008); L. salivarius DSM_20555 (ACGT01000005.1, США, 2013) и AH43348 (NBEV01000000, Ирландия, 2017); L. acidophilus ATCC-4356 (JRUT01000000, Аргентина, 2014), CIP- 76.13 (CBLQ010000000, Франция, 2013) и DSM-20079 (CP020620, Южная Корея, 2018); B. animalis subsp. lactis BI-04 (NZ_CP085838.1, США, 2018) и ATCC27536 (NZ_ AWFL00000000, Япония, 2015); B. longum DSM20219 (NZ_FNRW01000000, США, 2016) и JCM1217 (AB591083, Япония, 2010); B. bifidum (NZ_FNRW01000000, США, 2016) и lw02 (NZ_CP149430, Китай, 2017). Сравнительный анализ геномов изолятов лактобактерий и бифидобактерий показал, что они имеют характеристики (размер генома, количество и протяженность генов, GC-состав), присущие штаммам соответствующих видов (табл. 2). Анализ чувствительности к АМП 9 функциональных классов (бета-лактамов, аминогликозидов, макролидов, тетрациклинов, фениколов, фторхинолонов, сульфаниламидов, гликолипидов и оксазолидинонов) показал, что все штаммы, выделенные из синбиотика Максилак® Бэби, были резистентны ко всем использованным антимикробным препаратам, кроме трех изолятов: B. longum проявлял чувствительность к хлорамфениколу, L. paracasei – к хлорамфениколу и линезолиду, L. paracasei – к хлорамфениколу (табл. 3). Полученные данные указывают на то, что препарат Максилак® Бэби может быть использован на фоне антибиотикотерапии без потери своей активности. Полученные нами данные по фенотипической резистентности пробиотических штаммов, выделенных из препарата Максилак® Бэби, согласуются с ранее опубликованными данными по анализу фенотипов резистентности вновь выделенных пробиотических штаммов [11]. Анализ геномов штаммов, выделенных из синбиотика Максилак® Бэби, на присутствие в них генетических детерминант антибиотикорезистентности с помощью двух биоинформатических ресурсов – KmerResistance 2.2 Центра геномной эпидемиологии и портала fIDBAC – выявил у лактобактерий наличие двух хромосомнолокализованных генов: dfrA42, кодирующего дигидрофорат-редуктазу и определяющего резистентность к аминогликозидам (L. plantarum и L. casei), и lmrB, кодирующего ABC-транспортер, определяющий устойчивость к линкомицину (L. rhamnosus). В геномах бифидобактерий идентифицированы: мутация в гене rpoB, кодирующем β-субъединицу РНК-полимеразы, ассоциированная с устойчивостью к рифампицину; мозаичный ген tet(W/N/W), определяющий устойчивость к тетрациклину; ген aph(3’)-Ia, который кодирует фермент аминогликозид-фосфотрансферазу, определяющую резистентность к антимикробным препаратам группы аминогликозидов канамицину, рибостамицину, ливидомицину, паромомицину и неомицину (B. animalis) (табл. 4). В геномах штаммов лактобактерий также идентифицированы криптические плазмиды repUS73 (L. plantarum) и repUS75 (L. paracasei и L. acidophilus), а также плазмида pLM58, несущая ген термоустойчивости clpL. Кроме того, во всех штаммах, кроме L. plantarum, в геномах идентифицированы мобильные генетические элементы, относящиеся к семействам IS5, IS30 и ISLre2 (табл. 5). Важно отметить, что в геномах лактобактерий выявленные мобильные генетические элементы не располагаются вблизи генов антибиотикорезистентности, в то время как в геномах бифидобактерий IS-элементы ISBian1 локализованы в непосредственной близости от генов tet(W/N/W). Такое соседство может оказывать влияние на возможность передачи гена другим бактериям или на изменение уровней экспрессии генов устойчивости к тетрациклину в штаммах Bifidobacterium spp. В геномах изучаемых штаммов не найдено генетических детерминант вирулентности. Этот факт можно рассматривать как благоприятный с точки зрения оценки безопасности использования консорциума этих штаммов в качестве пробиотического препарата. С помощью веб-ресурса Центра геномной эпидемиологии Restriction-Modification Finder-1.1 в геномах изучаемых штаммов L. paracasei, L. salivarius и L. acidophilus идентифицированы системы рестрикции- модификации I типа S.Lpa37I (сайт узнавания AGGNNNNNNTCNNC) и II типа M.Lpa37II (сайт узнавания CTCCA) (NOKL01000002). Функция данных систем состоит в защите от чужеродной генетической информации, обеспечивает разрезание инородной плазмидной и фаговой ДНК, проникающей в бактериальную клетку. В штаммах L. plantarum, L. casei и L. rhamnosus систем рестрикции-модификации не выявлено. В геномах изучаемых штаммов Bifidobacterium spp. также идентифицирована система рестрикции-модификации II типа BanLI, которая включает в себя одну эндонуклеазу рестрикции BanLI (сайт узнавания RTCAGG) и две метилтрансферазы – M.BanLI (сайт метилирования RTCAGG) и M.BanLII (сайт метилирования GGWCC) (CP002915). Функция данных систем состоит в защите от чужеродной генетической информации, обеспечивает разрезание инородной плазмидной и фаговой ДНК, проникающей в бактериальную клетку. Заключение Настоящее исследование посвящено полногеномному секвенированию и характеристике полных геномов изолятов лактобактерий и бифидобактерий, выделенных из синбиотика Максилак® Бэби. Идентификация изолятов на основе анализа полных геномов показала их принадлежность к 6 видам лактобактерий: L. plantarum, L. casei, L. rhamnosus, L. paracasei, L. salivarius и L. acidophilus и к 3 видам бифидобактерий – B. animalis subsp. lactis, B. longum и B. bifidum, что соответствует заявленному составу препарата. Уровень идентичности анализируемых геномов с референс-штаммами, размещенными в базе данных GenBank, достаточно высок – от 98 до 100%. Размеры геномов и GC-состав изучаемых штаммов также аналогичны соответствующим показателям референс-штаммов из базы данных GenBank – от 1 962 720 до 3 202 014 п.н. и 33,16–48,61% соответственно для лактобактерий и 2 027 327, 1 489 24 9, 2 272 336 п.н., 61,23, 60,29 и 62,50% соответственно – для бифидобактерий [21]. Анализ геномов изучаемых изолятов лактобактерий на наличие генов антибиотикорезистентности выявил два хромосомнолокализованных гена: dfrA42, кодирующий дигидрофорат-редуктазу и определяющий резистентность к аминогликозидам (L. plantarum и L. casei), и lmrB, кодирующий ABC-транспортер, определяющий устойчивость к линкомицину (L. rhamnosus). Однако хромосомная их локализация указывает на малую вероятность передачи данных генетических детерминант другим бактериям [22]. Безопасность изучаемых изолятов лактобактерий и бифидобактерий подтверждается также тем, что они не несут каких-либо генетических детерминант вирулентности. Кроме того, геномы изучаемых штаммов лактобактерий и бифидобактерий можно оценить как существенно «защищенные» от интервенции чужеродной ДНК других бактерий, в том числе несущих гены антибиотикорезистентности и вирулентности. Таким образом, полученные в ходе исследования данные позволяют сделать вывод о безопасности лактобактерий и бифидобактерий, выделенных из консорциума синбиотика Максилак® Бэби, с точки зрения оценки возможности передачи генетических детерминант антибиотикорезистентности другим бактериям микробиома человека. Полученные данные могут быть использованы клиницистами с целью коррекции различных патологических состояний, требующих назначения пробиотиков. Одним из таких пробиотиков является синбиотик Максилак®. Синбиотик Максилак® – это комплекс пробиотических полезных бактерий и пребиотического компонента для нормализации микрофлоры желудочно- кишечного тракта в любых ситуациях ее нарушения для взрослых и детей с 3 лет, а синбиотик Максилак® Бэби может применяться у детей уже с рождения. Пребиотик усиливает действие пробиотических бактерий, обеспечивая питательную среду для быстрого их роста и размножения. В каждой капсуле Максилак® содержится 4,5 млрд КОЕ полезных пробиотических бактерий, именно поэтому достаточно всего 1 капсулы в день, что значительно повышает приверженность к терапии. Благодаря доказанной устойчивости к антибиотикам пробиотических штаммов синбиотика Максилак® возможен его совместный прием с антибиотиками уже с первого дня лечения, что, в свою очередь, способствует ускорению выздоровления [23, 24]. Литература 1. Gibson G.R., Hutkins R., Sanders M.E. et al. Expert consensus document: the International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2017; 14 (8): 491–502. 2. Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ordóñez A. et al. Update of the list of QPS recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 14: suitability of taxonomic units notified to EFSA until March 2021. EFSA J. 2021; 19: e06689. 3. Alexander M., Newman M.D., Mehereen M.D. The role of probiotics, prebiotics and synbiotics in combating multidrug‑resistant organisms. Clin. Ther. 2020; 42: 1637– 1648. 4. Olesen S.W., Barnett M.L., MacFadden D.R. et al. The distribution of antibiotic use and its association with antibiotic resistance. Elife. 2018; 7: e39435. 5. Luchen C.C., Chibuye M., Spijker R. et al. Impact of antibiotics on gut microbiome composition and resistome in the first years of life in low- to middleincome countries: a systematic review. PLoS Med. 2023; 20 (6): e1004235. 6. Crits-Christoph A., Hallowell H.A., Koutouvalis K. et al. Good microbes, bad genes? The dissemination of antimicrobial resistance in the human microbiome. Gut Microbes. 2022; 14 (1): 2055944. 7. Fatahi-Bafghi M., Naseri S., Alizehi A. Genome analysis of probiotic bacteria for antibiotic resistance genes. Antonie Van Leeuwenhoek. 2022; 115 (3): 375–389. 8. Fraqueza M.J. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from dry-fermented sausages. Int. J. Food Microbiol. 2015; 212: 76–88. 9. Ojha A.K., Shah N.P., Mishra V. Conjugal transfer of antibiotic resistances in Lactobacillus spp. Curr. Microbiol. 2021; 78 (8): 2839–2849. 10. Rozman V., Mohar Lorbeg P., Accetto T., et al. Characterization of antimicrobial resistance in lactobacilli and bifidobacteria used as probiotics or starter cultures based on integration of phenotypic and in silico data. Int. J. Food Microbiol. 2020; 314: 108388. 11. Anisimova E.A., Yarullina D.R. Antibiotic resistance of Lactobacillus strains. Curr. Microbiol. 2019; 76 (12): 1407–1416. 12. Duranti S., Lugli G.A., Mancabelli L. et al. Prevalence of antibiotic resistance genes among human gut-derived Bifidobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 2017; 83 (3): e02894-16. 13. Marbun K.T., Sugata M., Purnomo J.S. et al. Genomic characterization and safety assessment of Bifidobacterium breve BS2-PB3 as functional food. J. Microbiol. Biotechnol. 2024; 34 (4): 871–879. 14. Maguire F., Jia B., Gray K.L. et al. Metagenomeassembled genome binning methods with short reads disproportionately fail for plasmids and genomic islands. Microbial Genomics. 2020; 6 (10): mgen000436. 15. Lugli G.A., Longhi G., Alessandri G. et al. The probiotic identity card: a novel “probiogenomics” approach to investigate probiotic supplements. Front. Microbiol. 2022; 12: 790881. 16. EFSA Panel on additives and products or substances used in animal feed (FEEDAP). Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA J. 2012; 10: 2740. 17. МУ 2.3.2.2789-10. Методические указания по санитарно- эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. 104 с. 18. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Клинические рекомендации МАКМАХ. 2024. Доступно по: https://www.antibiotic.ru/minzdrav/category/clinicalrecommendations/ (дата обращения 17.02.2024). 19. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 1987; 1: 19–21. 20. Слукин П.В., Кукес Е.А., Фурсова А.Д. и др. Синбиотики как средство борьбы против формирующихся и зрелых биопленок патогенных микроорганизмов. Инфекционные болезни. 2022; 20 (4): 69–76. 21. Milani C., Lugli G.A., Duranti S. et al. Genomic encyclopedia of type strains of the genus Bifidobacterium. Appl. Environ. Microbiol. 2014; 80 (20): 6290–6302. 22. Jaimee G., Halami P.M. Emerging resistance to aminoglycosides in lactic acid bacteria of food origin – an impending menace. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016; 100 (3): 1137–1151. 23. Ардатская М.Д. Роль синбиотиков в коррекции нарушений микробиоты кишечника и повышенной проницаемости кишечной стенки. Consilium Medicum. 2024; 26 (5): 332–340. 24. Инструкция-вкладыш по медицинскому применению препарата Максилак®, свидетельство гос. регистрации № АМ.01.48.01.003.Е.000010.02.18 от 12.02.2018.