ВИРУС-АССОЦИИРОВАННЫЕ ЦЕРВИКАЛЬНЫЕ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ НЕОПЛАЗИИ ЛЕГКОЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ: ВОЗМОЖНОСТИ ЭФФЕКТИВНОГО ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ

Леваков С.А., Шешукова Н.А., Джафарова М.М. и др. Вирус-ассоциированные цервикальные интраэпителиальные неоплазии легкой степени тяжести: возможности эффективного эпигенетического лечения. Зарождение жизни. 2024; 2: 14–20. DOI 10.46393/27826384_2024_2_14–20

Резюме
Актуальность. Персистирующая инфекция, вызванная вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого риска, является одной из основных причин цервикальных интраэпителиальных неоплазий шейки матки и рака шейки матки, но отдельные гены и другие клинические факторы также оказывают важное влияние на прогрессирование неопластических процессов в шейке матки. Таким образом, разработка индивидуальных планов лечения для разных групп пациентов в соответствии с факторами риска прогрессирования цервикальных интраэпителиальных неоплазий шейки матки может помочь уменьшить заболеваемость раком шейки. Цели. Целью данной работы было оценить эффективность эпигенетической терапии у женщин репродуктивного возраста с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I степени (CIN I) на основании оценки вирусной нагрузки и данных молекулярно-генетического исследования. Материалы и методы. Исследование состояло из двух групп пациенток: I группа – группа контроля (со здоровой шейкой матки); II группа – пациентки с CIN I. Исследование было направлено на нахождение зависимости относительной экспрессии генов, кодирующих никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, и вирусной нагрузки до и после лечения препаратом Цервикон®-ДИМ у пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями легкой степени тяжести. Результаты. Через 6 месяцев лечения дииндолилметаном женщин с CIN I происходит снижение уровня вирусной нагрузки с 3,8 lg [3,5; 4,5] до 3,1 lg [2,75; 3,4] (р = 0,009) и изменение экспрессии генов α4-nAChR (р = 0,032), α6-nAChR (р = 0,006), β1-nAChR (р = 0,022) и β2-nAChR (р = 0,001). Выводы. Исходя из полученных данных, можно сделать предположение о том, что для профилактики прогрессирования цервикальных интраэпителиальных неоплазий легкой степени тяжести целесообразно назначение дииндолилметана для снижения уровня вирусной нагрузки.
Цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN) являются предшественником рака шейки матки (РШМ) – одной из ведущих причин смертности от злокачественных новообразований среди женщин во всем мире. Согласно данным всемирной статистической службы GLOBOCAN, в 2022 году было зарегистрировано 660 000 новых случаев заболевания и 350 000 смертей по всему миру (1). Сегодня по-прежнему очень важным является понимание механизмов прогнозирования прогрессирования CIN I, поскольку до настоящего времени не существует единого мнения по тактике ведения пациенток с данной патологией по причине высокой вероятности ее регресса естественным путем. Важный интерес представляют недавно проведенные исследования, которые продемонстрировали участие никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) в регуляции клеточной пролиферации, миграции, дифференцировки и, следовательно, в случае рака – в росте опухоли, ангиогенезе и метастазировании злокачественных новообразований различных локализаций [2, 3]. Было изучено, что на плоскоклеточную метаплазию в зоне трансформации шейки матки влияет холинергическая сигнализация. Это может быть основано на дифференциальной реакции цилиндрического и плоского эпителия и подлежащей стромы на ацетилхолин (АЦХ) [4]. Поскольку никотин и его производные концентрируются в слизи шейки матки, сигнализация nAChR может быть важным молекулярным кофактором канцерогенеза шейки матки, зависящего от ВПЧ. В настоящее время для лечения дисплазии шейки матки применяется отечественный лекарственный препарат Цервикон®-ДИМ, зарегистрированный в Российской Федерации в 2018 году, который в качестве действующего вещества содержит 3,3’-дииндолилметан. В основе терапевтического эффекта дииндолилметана лежит его способность ускорять элиминацию инфицированных ВПЧ и трансформированных клеток. Препарат способен избирательно действовать на ВПЧ-инфицированные эпителиальные клетки шейки матки с аномально измененным метаболизмом (клетки, находящиеся в состоянии клеточного стресса), независимо от места их локализации и степени опухолевой трансформации. Цервикон®-ДИМ, обладая локальным действием, проникает внутрь вирус-инфицированных клеток и через активацию молекулярно-генетических механизмов запускает процесс их физиологической гибели – апоптоз. Кроме того, препарат препятствует образованию канцерогенного метаболита эстрогена путем индукции активности цитохрома CYP1A1, ответственного за преимущественное образование функционального метаболита 2-гидроксиэстрона (2-OHE1), стимулирующего экспрессию онкогенов ВПЧ [5]. Через подавление экспрессии онкогена Е7 ВПЧ DIM блокирует патологическую пролиферацию ВПЧ-инфицированных клеток. [6]. Положительный эффект использования препарата Цервикон®-ДИМ при лечении CIN I–II оценивался в ряде проведенных в России исследований [7]. Однако в этих исследованиях и в работах зарубежных авторов не проводилась оценка влияния дииндолилметана на экспрессию никотиновых ацетилхолиновых рецепторов при лечении интраэпителиальных поражений шейки матки. Это и явилось основанием для проведения нашего исследования. Цель исследования – оценка эффективности эпигенетического лечения пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями легкой степени тяжести на основании оценки вирусной нагрузки и данных молекулярно-генетического исследования. Материалы и методы В исследовании приняли участие 95 женщин в возрасте от 18 до 45 лет с наличием ВПЧ ВКР, которые были разделены на две группы: I – основная группа (53 пациентки) с морфологически верифицированной цервикальной интраэпителиальной неоплазией шейки матки I степени, II – группа сравнения (42 женщины) с отсутствием интраэпителиальных поражений шейки матки (NILM) по результатам цитологического исследования. На первом этапе исследования всем женщинам проводилось качественное определение ВПЧ высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 , 58, 59 и 68 типов) с указанием типа вируса в отделяемом из цервикального канала методом Real-time PCR. При выявлении ВПЧ высокого канцерогенного риска проводилось количественное определение вирусной нагрузки методом Real-time PCR. ПЦР в реальном времени проводили на приборе LightCycler 96 (Roche) с использованием реагента qPCRmix-HS SYBR (Evrogen) согласно инструкции производителя по следующей схеме: 95 °C длительностью 150 секунд; 45 циклов 95 °C длительностью 20 секунд; 60 °C длительностью 20 секунд; 72 °C длительностью 20 секунд. На втором этапе исследования показанием для проведения цитологического исследования явилось наличие ВПЧ ВКР. Всем женщинам с аномальной цитологической картиной проводилась расширенная кольпоскопия. Показаниями для проведения биопсии шейки матки явились HSIL по данным цитологического исследования и/или LSIL в сочетании с аномальной кольпоскопической картиной. Группы были сопоставимы по анамнестическим данным, паритету, наличию гинекологических и соматических заболеваний. Таким образом, критериями включения в исследование для обеих групп являлись: возраст пациенток от 18 до 45 лет, наличие ВПЧ высокого канцерогенного риска, отсутствие указаний на сделанную прививку от ВПЧ, а также наличие письменного информированного согласия на участие в исследовании. На следующем этапе обследования всем женщинам основной группы и группы сравнения проводилось молекулярно-генетическое исследование – определение уровня экспрессии генов, кодирующих различные субтипы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (α2-nAChR, α3-nAChR, α4-nAChR, α5-nAChR, α6-nAChR, α7-nAChR, α9-nAChR, α10-nAChR, β1-nAChR, β2-nAChR, β3-nAChR, β4-nAChR, γ-nAChR, δ-nAChR и ε-nAChR). В первой группе пациенток материалом для исследования был биоптат шейки матки и соскоб из цервикального канала, а у женщин группы сравнения – отделяемое с шейки матки, полученное при взятии мазков на цитологическое исследование. При заборе материала биоптаты шейки матки или цитобраш погружали в стерильную пробирку. В каждый образец добавлялся 1 мл тризола с целью ингибирования работы РНКаз. Крышки пробирок с образцами плотно закручивали и маркировали. Образцы для исследования транспортировали в лабораторию мембранных и биоэнергетических систем ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук в течение двух часов после взятия биологического материала. Выделение тотальной мРНК проводилось по протоколу Invitrogen. Суммарную РНК использовали в качестве матрицы для построения комплементарной ДНК (кДНК) с помощью набора MMLV RT kit (Evrogen). Для синтеза первых цепей кДНК применяли специфические праймеры, комплементарные высококонсервативным участкам локусов генов, кодирующих никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (α2-nAChR, аα3-nAChR, α4-nAChR, α5-nAChR, α6-nAChR, α7-nAChR, α9-nAChR, α10-nAChR, β1-nAChR, β2-nAChR, β3-nAChR, β4-nAChR, γ-nAChR, δ-nAChR и ε-nAChR) (табл.1). Статистическая обработка данных исследования осуществлялась с использованием программного пакета STATISTICA версии 13.0 и программы Microsoft Excel (Excel 2016 (16) – Microsoft Office 2016). В статистическом анализе для описания характеристик данных применяли различные методы в зависимости от типа данных. Исследование выполнено в соответствии со стандартами «Надлежащей клинической практики». Проводимое исследование было одобрено комиссией Локального этического комитета ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (протокол № 01-22 от 24.01.2022). На заключительном этапе обследования все пациентки основной группы были разделены на две подгруппы: первые (n = 25) получали дииндолилметан по 100 мг интравагинально 2 раза в сутки на протяжении 6 месяцев согласно инструкции по применению препарата, вторые (n = 28) – женщины, которым проводилось динамическое наблюдение. Следует отметить, что побочных эффектов при лечении отмечено не было ни в одном случае. Результаты исследования и их обсуждение Результаты количественного определения ДНК ВПЧ в основной группе и группе сравнения до и после лечения представлены на рисунке 1. Уровень вирусной нагрузки у пациенток с CIN I (3,8 lg [3,5; 4,5]) был выше по сравнению с контрольной группой (3,7 lg [3,5; 4.0]), однако значимость различий была несущественной. Через 6 месяцев лечения дииндолилметаном зарегистрировано значимое снижение вирусной нагрузки у пациенток основной группы: с 3,8 lg [3,5; 4,5] до 3,1 lg [2,75; 3,4] (р = 0,009) (рис 1). Результаты молекулярно-генетического исследования у женщин основной группы и группы контроля показали, что экспрессия генов α3-nAChR, α10-nAChR не была зарегистрирована. Экспрессия генов α5-nAChR была сопоставима у женщин в обеих группах и составила 2,0124 для основной группы и 1,5058 для группы контроля. Уровень экспрессии α2-nAChR, α4-nAChR и β2-nAChR был значительно выше в группе контроля по сравнению с основной группой (рис. 2). Обращает на себя внимание, что экспрессия генов β4-nAChR (1,8393) определялась только у женщин группы контроля и ни в одном случае – у пациенток основной группы. Напротив, экспрессия генов β3-nAChR (448,831), ε-nAChR (207,19) и δ-nAChR (1,0722) имела место только у пациенток основной группы (рис. 3). У пациенток основной группы по сравнению с группой контроля достоверно выше определялась экспрессия следующих генов: α6-nAChR(29,49), α7-nAChR(3,5036), α9-nAChR(11,528), β1-nAChR(26,926) и γ-nAChR(8,354) (рис. 4). После проведенного лечения на основании проведенного молекулярно-генетического исследования в динамике нами были получены следующие результаты. Динамика уровня экспрессии рецепторов α2-nAChR, α5-nAChR, α9-nAChR и ε-nAChR достоверно не менялась (рис. 5). Обращает на себя внимание, что экспрессия гена γ-nAChR не определялась вообще. Уровень экспрессии β3-nAChR был достоверно ниже по сравнению с результатами до лечения (рис. 6). Напротив, экспрессия генов α3-nAChR, α4-nAChR, α6-nAChR, α7-nAChR, β1-nAChR и β2-nAChR была значительно выше (рис. 7). Нами проведена оценка корреляции генов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов с уровнем вирусной нагрузки (табл. 1). Полученные результаты позволили определить важные параллели между уровнями экспрессии генов α2-nAChR, α5-nAChR, α10-nAChR, β2-nAChR, β4-nAChR, ε-nAChR и уровнем вирусной нагрузки ВПЧ. Умеренная положительная корреляционная зависимость выявлена между вирусной нагрузкой и экспрессией генов α5-nAChR. Для других генов была определена отрицательная взаимосвязь с уровнем вирусной нагрузки (рис. 8). По другим генам не выявлено значимых взаимосвязей между уровнями их экспрессии и вирусной нагрузкой. Проведенное нами исследование показало, что существует большое разнообразие никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, специфичных для ВПЧ ВКР – инфицированных клеток неизмененного эпителия цервикального канала, и при наличии цервикальной интраэпителиальной неоплазии легкой степени тяжести. При наличии ВПЧ ВКР и отсутствии интраэпителиальных поражений шейки матки имеет место экспрессия следующих генов: α2-nAChR, α4-nAChR, α5-nAChR, α6-nAChR, α7-nAChR, α9-nAChR, β1-nAChR, β2-nAChR, γ-nAChR. А при ВПЧ ВКР-ассоциированных степени тяжести CIN I – α2-nAChR, α4-nAChR, α5-nAChR α6-nAChR, α7-nAChR, α9-nAChR, β1-nAChR, β2-nAChR, β3-nAChR, γ-nAChR, δ-nAChR, ε-nAChR. Субъединица α-5 nAChR, которая является продуктом гена CHRNA5, участвует в пролиферации опухолевых клеток и ингибировании апоптоза [8]. В нашем исследовании уровень экспрессии данного маркера был сопоставим в обеих группах, что может указывать на то, что изменения при CIN I не сопровождаются выраженной пролиферацией клеток и остаются подконтрольным процессом. Анализ дифференциальной экспрессии субъединиц nAChR в атипических клетках по сравнению с нормальными клетками выявил повышенную экспрессию только α6-nAChR, α7-nAChR, α9-nAChR, β1-nAChR, β3-nAChR, γ-nAChR, δ-nAChR, ε-nAChR, тогда как другие субъединицы рецепторов в данной группе не экспрессировались вовсе, или их экспрессия была сопоставима. После лечения отмечено еще большее повышение уровня экспрессии генов α6-nAChR, α7-nAChR, β1-nAChR. Интересными представляются также результаты, указывающие на то, что после эпигенетического лечения имела место тенденция к повышению экспрессии тех субъединиц nAChR, которые отсутствовали либо были достоверно ниже, чем в группе сравнения, – α3-nAChR, α4-nAChR, β2-nAChR. Также следует обратить внимание на снижение уровня гена β3-nAChR и отсутствие экспрессии гена γ-nAChR на фоне эпигенетического лечения. Повышенный уровень вирусной нагрузки у пациенток с CIN I по сравнению с женщинами ВПЧ ВКР-инфицированными, но без наличия атипических клеток в цервикальном канале подтверждает роль ВПЧ ВКР в развитии предраковых процессов шейки матки. Кроме того, проведенное нами исследование позволило выявить положительную корреляционную связь между уровнем вирусной нагрузки и наличием гена α6- nAChR, а также отрицательную корреляционную связь между экспрессией α2-nAChR, β1-nAChR, β2-nAChR и ε-nAChR, поэтому данную взаимосвязь еще предстоит изучить в дальнейших исследованиях. Таким образом, полученные нами результаты исследования свидетельствуют о том, что экспрессия субъединиц никотиновых ацетилхолиновых рецепторов динамична. Назначение дииндолилметана влияет на уровень экспрессии следующих генов nAChR: α3-nAChR, α4-nAChR, α6-nAChR, α7-nAChR, β1-nAChR, β2-nAChR, β3-nAChR и γ-nAChR. Это показывает его воздействие на холинергическую систему. Следовательно, нельзя исключать, что в определенных случаях стимуляция с помощью конкретных субъединиц никотиновых ацетилхолиновых рецепторов может специфически воздействовать на атипические клетки, то есть, обладая противоопухолевым действием, дииндолилметан может воздействовать на процессы регрессии или прогрессирования CIN I. В этой связи, а также принимая во внимание, что в литературе недостаточно данных о физиологической роли рецепторов nAChR и их влиянии на специфические рецепторы для определенных клеток тканей, представляется перспективным провести проспективное наблюдение по оценке динамики экспрессии никотиновых ацетилхолиновых рецепторов при наличии цервикальных интраэпителиальных неоплазий различной степени тяжести, в том числе и в зависимости от проводимой эпигенетической терапии.

Литература
1. Bray F., Laversanne M., Sung H., Ferlay J., Siegel R.L., Soerjomataram I., Jemal A. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 2024; 74: 229–63. 2. Aronowitz A.L., Ali S.R., Glaun M.D.E., Amit M. Acetylcholine in Carcinogenesis and Targeting Cholinergic Receptors in Oncology. Adv. Biol. (Weinh). 2022; 6 (9): e2200053. 3. Jiménez-Pompa A., Albillos A. Nicotinic Receptors in Human Chromaffin Cells: Characterization, Functional and Physical Interactions between Subtypes and Regulation. Int. J. Mol. Sci. 2024; 25 (4): 2304. 4. Calleja-Macias I.E., Kalantari M., Bernard H.U. Cholinergic signaling through nicotinic acetylcholine receptors stimulates the proliferation of cervical cancer cells: an explanation for the molecular role of tobacco smoking in cervical carcinogenesis? Int. J. Cancer. 2009; 124 (5): 1090–1096. 5. Sepkovic D.W., Stein J., Carlisle A.D., Ksieski H.B., Auborn K., Bradlow H.L. Diindolylmethane inhibits cervical dysplasia, alters estrogen metabolism, and enhances immune response in the K14-HPV16 transgenic mouse model. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2009; 18 (11): 2957–64. 6. Зароченцева Н.В., Джиджихия Л.К. Возможности применения препарата Цервикон®-ДИМ у пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями. Вопросы практической кольпоскопии. Генитальные инфекции. 2022; 3: 40–46. 7. Сухих Г.Т., Ашрафян Л.А., Киселев В.И. и др. Исследование эффективности и безопасности препарата на основе дииндолилметана у пациентов с цервикальной интраэпителиальной неоплазией (CIN1–2). Акушерство и гинекология. 2018; 9: 91–98. 8. Tu S.H., Ku C.Y., Ho C.T. et al. Tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate inhibits nicotine– and estrogeninduced α9-nicotinic acetylcholine receptor upregulation in human breast cancer cells. Mol. Nutr. Food Res. 2011; 55 (3): 455–466.