ОРИГИНАЛЬНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ ДИГИДРОАКРИДОНА ПРОЯВЛЯЕТ АНТИБЛАСТОМНЫЕ СВОЙСТВА В ОПУХОЛЕВЫХ СИСТЕМАХ
Пакина В.А., Иксанова Е.З., Толстов М.В. и др. Оригинальное производное дигидроакридона проявляет антибластомные свойства в опухолевых системах. Фармакология & Фармакотерапия. 2024; 1: 8–12. DOI 10.46393/27132129_2024_1_8
На органоидной модели EGFR-экспрессирующего тройного негативного рака молочной железы 3-пиридинкарбамид 2-амино-5-метилпиридин (соединение ЛХТ-13-19) вызывает зависимую от концентрации циторедукцию с GI50, рав- ным 16,24 мкМ (95% доверительный интервал 4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005). Курсовое введение ЛХТ-13-19 в дозе 2 мг/кг в сутки в течение 10 дней мышам с ксенографтной опухолью того же происхождения увеличивало выживаемость лабораторных животных до медианного значения 31 день против 25 дней в контрольной группе (log rank = 5,441; р = 0,02) и сопровождалось торможением роста опухоли и ее метастазирования. Опухолевая цито- редукция под действием ЛХТ-13-19 была обусловлена селективным воздействием на EGFR-экспрессирующие опухо- левые клетки. Вещество может рассматриваться как потенциальный кандидат в противоопухолевое лекарственное средство. Злокачественные новообразования сохраняют лидирующие позиции в структуре смертности населе- ния на планете, при этом рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди всех опухолевых процессов в женской популяции [1]. Наряду с хирургическим лече- нием и лучевой терапией применение противоопухоле- вых лекарственных средств является одной из основных стратегий лечения пациентов с этим заболеванием. В последние годы был достигнут значительный прогресс в области лекарственной терапии РМЖ, свя- занный главным образом с применением средств мо- лекулярно-направленной (таргетной) терапии, в част- ности, у лиц с Her2/neu-позитивными вариантами опухоли [2, 3]. При этом выявление тройного негативно- го (ТН) молекулярного типа РМЖ, характеризующегося отсутствием или гипоэкспрессией эстрогеновых и про- гестероновых рецепторов, Her2/neu, Ki-57-негативно- стью, сопряжено с крайне неблагоприятным прогнозом в том числе вследствие ограничения эффективных тера- певтических опций [4]. Это делает изыскание потенци- альных мишеней и их лекарственных лигандов чрезвы- чайно актуальной задачей онкофармакологии. В недавно появившихся публикациях указыва- ется на драйверное значение рецептора эпидермаль- ного фактора роста (EGFR) в прогрессии ТН РМЖ [5] и придается особое значение анти-EGFR фармаколо- гическим агентам как средствам контроля канцеро- генеза [6]. Специалистами из АО «Всесоюзный науч- ный центр по безопасности биологически активных веществ» в ходе широкого внеэкспериментального скрининга новых молекул был выделен ряд веществ – производных дигидроакридона – с высокой вероятно- стью противоопухолевой активности [7]. В частности, было установлено, что соединение 9-амино-3,3-диме- тил-3,4-дигидроакридин-1 (2H)-он 2-гидроксисукци- нат с лабораторным шифром ЛХТ-17-19 эффективно подавляет рост ксенографтного рака мочевого пузы- ря [7]. Идентификация и последующий синтез новых соединений упомянутого класса сделали возможным проведение их экспериментального исследования в мо- дельных опухолевых системах и обусловили выполне- ние настоящего исследования. Цель исследования – определить особенности реализации противоопухолевой активности нового соединения дигидроакридона в модельных опухоле- вых системах – органоидной и ксенографтной моделях ЕGFR-позитивного ТН РМЖ. Исследование проведено при неукоснительном следовании положениям приказа Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении принципов над- лежащей лабораторной практики» и принципам гуман- ного обращения с лабораторными животными. Про- токол экспериментального исследования в 2022 г. был рассмотрен и одобрен на заседании Локального этиче- ского комитета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Се- ченова Минздрава России (Сеченовский Университет). В работе изучено оригинальное вещество – 3-пи- ридинкарбамид 2-амино-5-метилпиридин (лаборатор- ный шифр учреждения-разработчика – ЛХТ-13-19), разработанное и полученное в АО «Всесоюзный науч- ный центр по безопасности биологически активных веществ» (г. Старая Купавна), в виде фармацевтической субстанции с чистотой 99,8%. Раствор ЛХТ-13-19 для инъекций, рабочий раствор для введения в среду куль- тивирования готовили ex tempore растворением мел- кокристаллического порошка в стерильном 0,9% изо- тоническом растворе хорида натрия при нагревании до 37 °С и постоянном помешивании. Эксперименты выполнены в ex vivo и in vivo мо- дельных системах: органоидной и ксенографтной моде- лях ТН РМЖ. Ткань опухоли с подтвержденным имму- ногистохимическим и молекулярным вариантом была получена интраоперационно у пациентки 68 лет с била- теральным поражением, не получавшей предшествую- щего химиотерапевтического лечения и давшей добро- вольное информированное согласие на использование биологического материала в исследовательских целях в онкологической клинике ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет). Образец тканей опухоли механически разделяли на мелкие кусочки с помощью микрохирур- гических ножниц и незамедлительно помещали в рас- твор для хранения тканей MACS (MilteNY Biotec, Герма- ния). Образцы хранили при температуре 40 °С не более 8 часов. Затем образцы переносили в MACS C (MilteNY Biotec, Германия) для гомогенизации тканей и далее в смесь ферментов Tumor Dissociation Kit того же произ- водителя для диссоциации клеток. Полученную суспен- зию центрифугировали при 3000g в течение 10 минут. Осадок разводили в 10 мл забуференного 0,9% изотони- ческого раствора хлорида натрия и снова центрифуги- ровали. Супернатант удаляли, а осадок разводили сре- дой DMEM/F-12 (Thermo Fisher Scientific, США). Часть клеток использовали для моделирования ксенографта, оставшуюся часть смешивали с Matrigel (Corning, США) в соотношении 1:2, 50 мкл смеси переносили в 24-луноч- ный планшет (TPP, Швейцария) и инкубировали при 37 °С в атмосфере 5% CO2 в течение 20 минут. В каждую лунку добавляли полную клеточную среду (750 мкл) и повторяли цикл инкубации. Культуральную среду об- новляли каждые 48 часов. Растущие органоиды наблю- дали под микроскопом PrimoVert (Carl Zeiss, Германия). Рекультивирование органоидов проводили раз в две не- дели. Жизнеспособность органоидных клеток ТН РМЖ на фоне семисуточного присутствия ЛХТ-13-19 оцени- вали с использованием набора для анализа пролифера- ции клеток CellTiter 96 Aqueous One Solution на основе MTS (Promega, США) [8]. Раствор производного акриди- на ежедневно добавляли в инкубационную среду в кон- центрациях 0,5; 2,0; 9,0; 60,0; 250,0 и 1000,0 мкМ. Ксенографтную модель ТН РМЖ воспроизводили на 8–10-недельных мышах-самках линии NOD SCID, при- обретенных в питомнике SPF-животных ФГБУН «Инсти- тут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемя- кина и Ю.А. Овчинникова» РАН. Животные содержались в условиях естественного освещения при неограничен- ном доступе к воде и корму в индивидуальных венти- лируемых клетках. Моделирование экспериментальной патологии проводили у наркотизированных изофлура- ном (наркозная приставка RWD для грызунов, Китай) животных, которым после удаления шерсти проводили Y-образный грудно-паховый разрез, обнажали 4-й пахо- вый жировой комок и вводили в него взвесь 2 × 106 опу- холевых клеток в матригеле в объеме 30–40 мкл [9]. После ушивания раны животные переводились в индивиду- альные клетки. После того как опухоль достигала раз- меров 150–180 мм3, животных разделяли на две группы по 10 особей в каждой: контроль и группа ЛХТ-13-19. Животным группы контроля вводили внутрибрюшинно 0,5 мл 0,9% изотонического раствора хлорида натрия, мы- шам второй группы – 2 мг/кг ЛХТ-13-19 в течение 10 дней однократно в сутки [10]. Наблюдение за животными осу- ществляли ежедневно, опухоль измеряли, для вычисления ее объема применяли формулу 1/6 × Д × Ш2, где Д – длина, Ш – ширина опухолевого узла [9]. На 30-е сутки выжив- ших животных выводили из эксперимента, подсчитыва- ли поверхностные метастазы в легких и головном мозге. На протяжении эксперимента контролировали болевой синдром с помощью мимической шкалы [11]. Живот- ным с умеренным и выраженным болевым синдромом дважды в сутки внутрижелудочно вводили кетопрофен в 2% крахмальном геле. Органоидная система ТН РМЖ, экспрессирующая EGFR, была разработана и морфологически валидирована (рис. 1 А–В). Семидневная инкубация органоидной культуры с 0,5–60,0 мкМ соединения дигидроакридона ЛХТ-13-19 сопро- вождалась торможением роста органоидов на фоне их инкуба- ции со всеми исследуемыми концентрациями соединения. Уве- личение концентрации ЛХТ-13-19 до 250 и 1000 мкМ приводило к существенному уменьшению размера органоидов за счет гибе- ли опухолевых клеток (рис. 1 Г). Расчетный индекс подавления роста органоидов (GI50) составил 16,24 мкМ (95% доверитель- ный интервал (ДИ) 4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005). Экспериментальное лечение мышей, несущих мутантный генотип ксенотрансплантатной карцино- мы молочной железы, экспрессирующей EGFR, привело к снижению числа отдаленных метастазов в головной мозг и легкие до 22,5 ± 3,4 против 88,6 ± 7,8 в контроль- ной группе (p = 0,001) (рис. 2 А). Одновременно мы наблю- дали значительное увеличение времени удвоения объема опухоли (рис. 2 Б и В): время удвоения опухоли увеличи- лось до 26,5 ± 4,4 суток в группе животных, получавших ЛХТ-13-19, тогда как в контрольной группе среднее время составляло 10,7 ± 2,7 суток (p = 0,005) (рис. 2 Б). Экспе- риментальная терапия ЛХТ-13-19 также продлевала вы- живаемость лабораторных мышей (рис. 2 Г), а медиана времени выживания в экспериментальной группе соста- вила 31 день против 25 дней в контрольной группе (лога- рифмический критерий 5,441; р = 0,02). При патоморфологическом исследовании ауто- псийного материала после экспериментального ле- чения ЛХТ-13-19 в остаточной опухоли наблюдалось уменьшение количества опухолевых структур до 30% просмотренных участков, с дистрофическими измене- ниями клеток и очагами фиброза. Эти результаты со- ответствуют III степени терапевтического патоморфоза по классификации I.D. Miller и соавт. [10]. При иммуно- гистохимическом анализе образцов не регистрировали EGFR-позитивного окрашивания мембран клеток. Обсуждение Значительные достижения в области молекулярной биологии рака и идентификация внутриклеточных путей канцерогенной клеточной трансформации и прогрессиро- вания стимулируют поиск перспективных лигандов, наце- ленных на макромолекулы-драйверы. EGFR представляет собой широко известную киназу, которая играет ключевую роль во внутриклеточной метаболической регуляции при многих видах рака. Ингибиторы киназы считаются эффек- тивной основой стратегии лечения рака легких, поджелу- дочной железы, молочной железы и др. предыдущих работах установлено, что соедине- ния дигидроакридона обладают антикиназной активно- стью и способны сдерживать прогрессию злокачествен- ных опухолей. В фокусе настоящего исследования было оригинальное отечественное вещество с высоким про- гностическим антибластомным потенциалом. В рамках одного исследования нам хотелось изучить особенности реализации противоопухолевого действия нового ве- щества на двух видах опухолевых моделей, воспроиз- водящих клеточно-тканевой и организменный уровни организации живых систем. При этом выбор пал на ТН РМЖ в силу того, что EGFR является одной из перспек- тивных мишеней для потенциального таргетного воз- действия [5]. Мы установили, что в органоидной системе EGFR-экспрессирующего ТН РМЖ ЛХТ-13-19 не только замедляет рост трехмерных опухолеподобных струк- тур, но и приводит к сокращению их размера, что может быть обусловлено как цитостатическим, так и цитоток- сическим действием вещества. Очевидно, полученный эффект не связан с ухудшением условий культивирова- ния, поскольку в параллельных трехмерных культурах пролиферация опухолевых клеток продолжалась. На ксенографтной модели заболевания, воспро- изведенной из того же, что и органоиды, исходного опухолевого материала, регистрировали увеличение продолжительности жизни мышей – носителей опу- холи человека, получавших экспериментальное лече- ние. Эффект был обусловлен замедлением опухолевой прогрессии в виде торможения роста первичного узла и ингибирования метастатической активности. Пред- ставляет интерес, что при патоморфологическом иссле- довании лекарственный патоморфоз, индуцированный ЛХТ-13-19, был связан в первую очередь с элиминацией EGFR-экспрессирующих опухолевых клеток, тогда как EGFR-негативный клеточный субстрат опухоли сохра- нялся. С этой селективностью, вероятно, связано отсут- ствие случаев полной редукции опухолевого процесса. Настоящее исследование не лишено недостат- ков и ограничений: во-первых, было бы интересным с точки зрения лекарственного контроля за эволюцией опухоли изучить особенности активности ЛХТ-13-19 в моделях второй и третьей генерации. Во-вторых, для подтверждения антикиназного действия нового веще- ства можно было бы определить экспрессию гена EGFR с определением мутационной нагрузки [5]. Понимая важность упомянутых обстоятельств, мы планируем осветить их в наших дальнейших работах. Выводы 1. Инкубация трехмерной органоидной культуры EGFR-экспрессирующего ТН РМЖ в присутствии 3-пиридинкарбамид 2-амино-5-метилпиридина (лабораторный шифр ЛХТ-13-19) сопровождает- ся зависимым от концентрации циторедуктив- ным эффектом с GI50, равным 16,24 мкМ (95% ДИ 4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005). 2. Введение мышам – носителям ксенографтного ТН РМЖ ЛХТ-13-19 в дозе 2 мг/кг в сутки в те- чение 10 дней увеличивало выживаемость ла- бораторных животных до медианного значения 31 день против 25 дней в контрольной группе (log rank = 5,441; р = 0,02) и сопровождалось тор- можением роста опухоли и ее метастазирования. 3. Опухолевая циторедукция под действием ЛХТ-13-19 была обусловлена селективным воз- действием на EGFR-экспрессирующие опухоле- вые клетки. Исследование проведено при поддержке гранта Российского научного фонда № 23-25-00097, https://rscf.ru/project/23-25-00097. Литература 1. Kern R., Correa S.C., Scandolara T.B. et al. Current advances in the diagnosis and personalized treatment of breast cancer: lessons from tumor biology. Per. Med. 2020; 17: 399–420. 2. Alexopoulos A., Karanikiotis C., Ardavanis A. et al. Safety and efficacy of RAD001 (Everolimus) administered upon relapse during or after adjuvant treatment in post-menopausal women with hormone receptor positive, HER2/neu negative locally advanced or metastatic breast cancer (CRAD001JGR08 «MELPOMENI» study). Anticancer Res. 2022; 42: 1031–1041. 3. Osborne C., Challagalla J.D., Eisenbeis C.F. et al. Ixabepilone and carboplatin for Hormone Receptor Positive/ HER2-neu negative and triple negative metastatic breast cancer. Clin. Breast Cancer. 2018; 18: e89–e95. 4. Schmid P., Cortes J., Dent R. et al. Event-free survival with pembrolizumab in early triple-negative breast cancer. N. Engl. J. Med. 2022; 386: 556–567. 5. Yin L., Duan J.J., Bian X.W., Yu S.C. Triple-negative breast cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast Cancer Res. 2020; 22: 61. 6. Lev S. Targeted therapy and drug resistance in triple-negative breast cancer: the EGFR axis. Biochem. Soc. Trans. 2020; 48: 657–665. 7. Кудрявцев М.Ю., Дерябина О.Н., Самышина Е.А. и др. К вопросу о противоопухолевой активности нового соединения – производного пиридина. Вестник «Био- медицина и Социология». 2021; 4: 52–59. 8. Nikulin S.V., Alekseev B.Y., Sergeeva N.S. et al. Breast cancer organoid model allowed to reveal potentially beneficial combinations of 3,3’-diindolylmethane and chemotherapy drugs. Biochimie. 2020; 179: 217–227. 9. Fernando W., Coyle K.M., Marcato P. Breast cancer xenograft murine models. Methods Mol. Biol. 2022; 2508: 31–44. 10. Miller I.D., Payne S., Ogston K.N. A new gistological grading system to assess response of breast cancer to primary chemotherapy. Int. J. Oncol. 2002; 20 (4): 791–796. 11. Langford D.J., Bailey A.L., Chanda M.L. et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat. Methods. 2010; 7: 447–449.