Пакина В.А., Иксанова Е.З., Толстов М.В. и др.
Оригинальное производное дигидроакридона
проявляет антибластомные свойства в опухолевых
системах. Фармакология & Фармакотерапия. 2024; 1:
8–12.
DOI 10.46393/27132129_2024_1_8
Оригинальное производное дигидроакридона
проявляет антибластомные свойства в опухолевых
системах. Фармакология & Фармакотерапия. 2024; 1:
8–12.
DOI 10.46393/27132129_2024_1_8
На органоидной модели EGFR-экспрессирующего тройного негативного рака молочной железы 3-пиридинкарбамид
2-амино-5-метилпиридин (соединение ЛХТ-13-19) вызывает зависимую от концентрации циторедукцию с GI50, рав-
ным 16,24 мкМ (95% доверительный интервал 4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005). Курсовое введение ЛХТ-13-19
в дозе 2 мг/кг в сутки в течение 10 дней мышам с ксенографтной опухолью того же происхождения увеличивало
выживаемость лабораторных животных до медианного значения 31 день против 25 дней в контрольной группе
(log rank = 5,441; р = 0,02) и сопровождалось торможением роста опухоли и ее метастазирования. Опухолевая цито-
редукция под действием ЛХТ-13-19 была обусловлена селективным воздействием на EGFR-экспрессирующие опухо-
левые клетки. Вещество может рассматриваться как потенциальный кандидат в противоопухолевое лекарственное
средство.
Злокачественные новообразования сохраняют
лидирующие позиции в структуре смертности населе-
ния на планете, при этом рак молочной железы (РМЖ)
занимает первое место среди всех опухолевых процессов
в женской популяции [1]. Наряду с хирургическим лече-
нием и лучевой терапией применение противоопухоле-
вых лекарственных средств является одной из основных
стратегий лечения пациентов с этим заболеванием.
В последние годы был достигнут значительный
прогресс в области лекарственной терапии РМЖ, свя-
занный главным образом с применением средств мо-
лекулярно-направленной (таргетной) терапии, в част-
ности, у лиц с Her2/neu-позитивными вариантами
опухоли [2, 3]. При этом выявление тройного негативно-
го (ТН) молекулярного типа РМЖ, характеризующегося
отсутствием или гипоэкспрессией эстрогеновых и про-
гестероновых рецепторов, Her2/neu, Ki-57-негативно-
стью, сопряжено с крайне неблагоприятным прогнозом
в том числе вследствие ограничения эффективных тера-
певтических опций [4]. Это делает изыскание потенци-
альных мишеней и их лекарственных лигандов чрезвы-
чайно актуальной задачей онкофармакологии.
В недавно появившихся публикациях указыва-
ется на драйверное значение рецептора эпидермаль-
ного фактора роста (EGFR) в прогрессии ТН РМЖ [5]
и придается особое значение анти-EGFR фармаколо-
гическим агентам как средствам контроля канцеро-
генеза [6]. Специалистами из АО «Всесоюзный науч-
ный центр по безопасности биологически активных
веществ» в ходе широкого внеэкспериментального
скрининга новых молекул был выделен ряд веществ –
производных дигидроакридона – с высокой вероятно-
стью противоопухолевой активности [7]. В частности,
было установлено, что соединение 9-амино-3,3-диме-
тил-3,4-дигидроакридин-1 (2H)-он 2-гидроксисукци-
нат с лабораторным шифром ЛХТ-17-19 эффективно
подавляет рост ксенографтного рака мочевого пузы-
ря [7]. Идентификация и последующий синтез новых
соединений упомянутого класса сделали возможным
проведение их экспериментального исследования в мо-
дельных опухолевых системах и обусловили выполне-
ние настоящего исследования.
Цель исследования – определить особенности
реализации противоопухолевой активности нового
соединения дигидроакридона в модельных опухоле-
вых системах – органоидной и ксенографтной моделях
ЕGFR-позитивного ТН РМЖ.
Исследование проведено при неукоснительном
следовании положениям приказа Минздрава России
от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении принципов над-
лежащей лабораторной практики» и принципам гуман-
ного обращения с лабораторными животными. Про-
токол экспериментального исследования в 2022 г. был
рассмотрен и одобрен на заседании Локального этиче-
ского комитета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Се-
ченова Минздрава России (Сеченовский Университет).
В работе изучено оригинальное вещество – 3-пи-
ридинкарбамид 2-амино-5-метилпиридин (лаборатор-
ный шифр учреждения-разработчика – ЛХТ-13-19),
разработанное и полученное в АО «Всесоюзный науч-
ный центр по безопасности биологически активных
веществ» (г. Старая Купавна), в виде фармацевтической
субстанции с чистотой 99,8%. Раствор ЛХТ-13-19 для
инъекций, рабочий раствор для введения в среду куль-
тивирования готовили ex tempore растворением мел-
кокристаллического порошка в стерильном 0,9% изо-
тоническом растворе хорида натрия при нагревании
до 37 °С и постоянном помешивании.
Эксперименты выполнены в ex vivo и in vivo мо-
дельных системах: органоидной и ксенографтной моде-
лях ТН РМЖ. Ткань опухоли с подтвержденным имму-
ногистохимическим и молекулярным вариантом была
получена интраоперационно у пациентки 68 лет с била-
теральным поражением, не получавшей предшествую-
щего химиотерапевтического лечения и давшей добро-
вольное информированное согласие на использование
биологического материала в исследовательских целях
в онкологической клинике ФГАОУ ВО Первый МГМУ
им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский
Университет). Образец тканей опухоли механически
разделяли на мелкие кусочки с помощью микрохирур-
гических ножниц и незамедлительно помещали в рас-
твор для хранения тканей MACS (MilteNY Biotec, Герма-
ния). Образцы хранили при температуре 40 °С не более
8 часов. Затем образцы переносили в MACS C (MilteNY
Biotec, Германия) для гомогенизации тканей и далее
в смесь ферментов Tumor Dissociation Kit того же произ-
водителя для диссоциации клеток. Полученную суспен-
зию центрифугировали при 3000g в течение 10 минут.
Осадок разводили в 10 мл забуференного 0,9% изотони-
ческого раствора хлорида натрия и снова центрифуги-
ровали. Супернатант удаляли, а осадок разводили сре-
дой DMEM/F-12 (Thermo Fisher Scientific, США). Часть
клеток использовали для моделирования ксенографта,
оставшуюся часть смешивали с Matrigel (Corning, США)
в соотношении 1:2, 50 мкл смеси переносили в 24-луноч-
ный планшет (TPP, Швейцария) и инкубировали при
37 °С в атмосфере 5% CO2 в течение 20 минут. В каждую
лунку добавляли полную клеточную среду (750 мкл)
и повторяли цикл инкубации. Культуральную среду об-
новляли каждые 48 часов. Растущие органоиды наблю-
дали под микроскопом PrimoVert (Carl Zeiss, Германия).
Рекультивирование органоидов проводили раз в две не-
дели. Жизнеспособность органоидных клеток ТН РМЖ
на фоне семисуточного присутствия ЛХТ-13-19 оцени-
вали с использованием набора для анализа пролифера-
ции клеток CellTiter 96 Aqueous One Solution на основе
MTS (Promega, США) [8]. Раствор производного акриди-
на ежедневно добавляли в инкубационную среду в кон-
центрациях 0,5; 2,0; 9,0; 60,0; 250,0 и 1000,0 мкМ.
Ксенографтную модель ТН РМЖ воспроизводили
на 8–10-недельных мышах-самках линии NOD SCID, при-
обретенных в питомнике SPF-животных ФГБУН «Инсти-
тут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемя-
кина и Ю.А. Овчинникова» РАН. Животные содержались
в условиях естественного освещения при неограничен-
ном доступе к воде и корму в индивидуальных венти-
лируемых клетках. Моделирование экспериментальной
патологии проводили у наркотизированных изофлура-
ном (наркозная приставка RWD для грызунов, Китай)
животных, которым после удаления шерсти проводили
Y-образный грудно-паховый разрез, обнажали 4-й пахо-
вый жировой комок и вводили в него взвесь 2 × 106 опу-
холевых клеток в матригеле в объеме 30–40 мкл [9]. После
ушивания раны животные переводились в индивиду-
альные клетки. После того как опухоль достигала раз-
меров 150–180 мм3, животных разделяли на две группы
по 10 особей в каждой: контроль и группа ЛХТ-13-19.
Животным группы контроля вводили внутрибрюшинно
0,5 мл 0,9% изотонического раствора хлорида натрия, мы-
шам второй группы – 2 мг/кг ЛХТ-13-19 в течение 10 дней
однократно в сутки [10]. Наблюдение за животными осу-
ществляли ежедневно, опухоль измеряли, для вычисления
ее объема применяли формулу 1/6 × Д × Ш2, где Д – длина,
Ш – ширина опухолевого узла [9]. На 30-е сутки выжив-
ших животных выводили из эксперимента, подсчитыва-
ли поверхностные метастазы в легких и головном мозге.
На протяжении эксперимента контролировали болевой
синдром с помощью мимической шкалы [11]. Живот-
ным с умеренным и выраженным болевым синдромом
дважды в сутки внутрижелудочно вводили кетопрофен
в 2% крахмальном геле.
Органоидная система ТН РМЖ, экспрессирующая
EGFR, была разработана и морфологически валидирована
(рис. 1 А–В). Семидневная инкубация органоидной культуры
с 0,5–60,0 мкМ соединения дигидроакридона ЛХТ-13-19 сопро-
вождалась торможением роста органоидов на фоне их инкуба-
ции со всеми исследуемыми концентрациями соединения. Уве-
личение концентрации ЛХТ-13-19 до 250 и 1000 мкМ приводило
к существенному уменьшению размера органоидов за счет гибе-
ли опухолевых клеток (рис. 1 Г). Расчетный индекс подавления
роста органоидов (GI50) составил 16,24 мкМ (95% доверитель-
ный интервал (ДИ) 4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005).
Экспериментальное лечение мышей, несущих
мутантный генотип ксенотрансплантатной карцино-
мы молочной железы, экспрессирующей EGFR, привело
к снижению числа отдаленных метастазов в головной
мозг и легкие до 22,5 ± 3,4 против 88,6 ± 7,8 в контроль-
ной группе (p = 0,001) (рис. 2 А). Одновременно мы наблю-
дали значительное увеличение времени удвоения объема
опухоли (рис. 2 Б и В): время удвоения опухоли увеличи-
лось до 26,5 ± 4,4 суток в группе животных, получавших
ЛХТ-13-19, тогда как в контрольной группе среднее время
составляло 10,7 ± 2,7 суток (p = 0,005) (рис. 2 Б). Экспе-
риментальная терапия ЛХТ-13-19 также продлевала вы-
живаемость лабораторных мышей (рис. 2 Г), а медиана
времени выживания в экспериментальной группе соста-
вила 31 день против 25 дней в контрольной группе (лога-
рифмический критерий 5,441; р = 0,02).
При патоморфологическом исследовании ауто-
псийного материала после экспериментального ле-
чения ЛХТ-13-19 в остаточной опухоли наблюдалось
уменьшение количества опухолевых структур до 30%
просмотренных участков, с дистрофическими измене-
ниями клеток и очагами фиброза. Эти результаты со-
ответствуют III степени терапевтического патоморфоза
по классификации I.D. Miller и соавт. [10]. При иммуно-
гистохимическом анализе образцов не регистрировали
EGFR-позитивного окрашивания мембран клеток.
Обсуждение
Значительные достижения в области молекулярной
биологии рака и идентификация внутриклеточных путей
канцерогенной клеточной трансформации и прогрессиро-
вания стимулируют поиск перспективных лигандов, наце-
ленных на макромолекулы-драйверы. EGFR представляет
собой широко известную киназу, которая играет ключевую
роль во внутриклеточной метаболической регуляции при
многих видах рака. Ингибиторы киназы считаются эффек-
тивной основой стратегии лечения рака легких, поджелу-
дочной железы, молочной железы и др.
предыдущих работах установлено, что соедине-
ния дигидроакридона обладают антикиназной активно-
стью и способны сдерживать прогрессию злокачествен-
ных опухолей. В фокусе настоящего исследования было
оригинальное отечественное вещество с высоким про-
гностическим антибластомным потенциалом. В рамках
одного исследования нам хотелось изучить особенности
реализации противоопухолевого действия нового ве-
щества на двух видах опухолевых моделей, воспроиз-
водящих клеточно-тканевой и организменный уровни
организации живых систем. При этом выбор пал на ТН
РМЖ в силу того, что EGFR является одной из перспек-
тивных мишеней для потенциального таргетного воз-
действия [5].
Мы установили, что в органоидной системе
EGFR-экспрессирующего ТН РМЖ ЛХТ-13-19 не только
замедляет рост трехмерных опухолеподобных струк-
тур, но и приводит к сокращению их размера, что может
быть обусловлено как цитостатическим, так и цитоток-
сическим действием вещества. Очевидно, полученный
эффект не связан с ухудшением условий культивирова-
ния, поскольку в параллельных трехмерных культурах
пролиферация опухолевых клеток продолжалась.
На ксенографтной модели заболевания, воспро-
изведенной из того же, что и органоиды, исходного
опухолевого материала, регистрировали увеличение
продолжительности жизни мышей – носителей опу-
холи человека, получавших экспериментальное лече-
ние. Эффект был обусловлен замедлением опухолевой
прогрессии в виде торможения роста первичного узла
и ингибирования метастатической активности. Пред-
ставляет интерес, что при патоморфологическом иссле-
довании лекарственный патоморфоз, индуцированный
ЛХТ-13-19, был связан в первую очередь с элиминацией
EGFR-экспрессирующих опухолевых клеток, тогда как
EGFR-негативный клеточный субстрат опухоли сохра-
нялся. С этой селективностью, вероятно, связано отсут-
ствие случаев полной редукции опухолевого процесса.
Настоящее исследование не лишено недостат-
ков и ограничений: во-первых, было бы интересным
с точки зрения лекарственного контроля за эволюцией
опухоли изучить особенности активности ЛХТ-13-19
в моделях второй и третьей генерации. Во-вторых, для
подтверждения антикиназного действия нового веще-
ства можно было бы определить экспрессию гена EGFR
с определением мутационной нагрузки [5]. Понимая
важность упомянутых обстоятельств, мы планируем
осветить их в наших дальнейших работах.
Выводы
1. Инкубация трехмерной органоидной культуры
EGFR-экспрессирующего ТН РМЖ в присутствии
3-пиридинкарбамид 2-амино-5-метилпиридина
(лабораторный шифр ЛХТ-13-19) сопровождает-
ся зависимым от концентрации циторедуктив-
ным эффектом с GI50, равным 16,24 мкМ (95% ДИ
4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005).
2. Введение мышам – носителям ксенографтного
ТН РМЖ ЛХТ-13-19 в дозе 2 мг/кг в сутки в те-
чение 10 дней увеличивало выживаемость ла-
бораторных животных до медианного значения
31 день против 25 дней в контрольной группе
(log rank = 5,441; р = 0,02) и сопровождалось тор-
можением роста опухоли и ее метастазирования.
3. Опухолевая циторедукция под действием
ЛХТ-13-19 была обусловлена селективным воз-
действием на EGFR-экспрессирующие опухоле-
вые клетки.
Исследование проведено при поддержке гранта
Российского научного фонда № 23-25-00097,
https://rscf.ru/project/23-25-00097.
Литература
1. Kern R., Correa S.C., Scandolara T.B. et al. Current advances
in the diagnosis and personalized treatment of breast
cancer: lessons from tumor biology. Per. Med. 2020; 17:
399–420.
2. Alexopoulos A., Karanikiotis C., Ardavanis A. et al. Safety
and efficacy of RAD001 (Everolimus) administered upon
relapse during or after adjuvant treatment in post-menopausal
women with hormone receptor positive,
HER2/neu negative locally advanced or metastatic breast
cancer (CRAD001JGR08 «MELPOMENI» study). Anticancer
Res. 2022; 42: 1031–1041.
3. Osborne C., Challagalla J.D., Eisenbeis C.F. et al. Ixabepilone
and carboplatin for Hormone Receptor Positive/
HER2-neu negative and triple negative metastatic breast
cancer. Clin. Breast Cancer. 2018; 18: e89–e95.
4. Schmid P., Cortes J., Dent R. et al. Event-free survival
with pembrolizumab in early triple-negative breast cancer.
N. Engl. J. Med. 2022; 386: 556–567.
5. Yin L., Duan J.J., Bian X.W., Yu S.C. Triple-negative breast
cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast
Cancer Res. 2020; 22: 61.
6. Lev S. Targeted therapy and drug resistance in triple-negative
breast cancer: the EGFR axis. Biochem. Soc. Trans.
2020; 48: 657–665.
7. Кудрявцев М.Ю., Дерябина О.Н., Самышина Е.А. и др.
К вопросу о противоопухолевой активности нового
соединения – производного пиридина. Вестник «Био-
медицина и Социология». 2021; 4: 52–59.
8. Nikulin S.V., Alekseev B.Y., Sergeeva N.S. et al. Breast cancer
organoid model allowed to reveal potentially beneficial
combinations of 3,3’-diindolylmethane and chemotherapy
drugs. Biochimie. 2020; 179: 217–227.
9. Fernando W., Coyle K.M., Marcato P. Breast cancer xenograft
murine models. Methods Mol. Biol. 2022; 2508:
31–44.
10. Miller I.D., Payne S., Ogston K.N. A new gistological grading
system to assess response of breast cancer to primary
chemotherapy. Int. J. Oncol. 2002; 20 (4): 791–796.
11. Langford D.J., Bailey A.L., Chanda M.L. et al. Coding of facial
expressions of pain in the laboratory mouse. Nat. Methods.
2010; 7: 447–449.
2-амино-5-метилпиридин (соединение ЛХТ-13-19) вызывает зависимую от концентрации циторедукцию с GI50, рав-
ным 16,24 мкМ (95% доверительный интервал 4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005). Курсовое введение ЛХТ-13-19
в дозе 2 мг/кг в сутки в течение 10 дней мышам с ксенографтной опухолью того же происхождения увеличивало
выживаемость лабораторных животных до медианного значения 31 день против 25 дней в контрольной группе
(log rank = 5,441; р = 0,02) и сопровождалось торможением роста опухоли и ее метастазирования. Опухолевая цито-
редукция под действием ЛХТ-13-19 была обусловлена селективным воздействием на EGFR-экспрессирующие опухо-
левые клетки. Вещество может рассматриваться как потенциальный кандидат в противоопухолевое лекарственное
средство.
Злокачественные новообразования сохраняют
лидирующие позиции в структуре смертности населе-
ния на планете, при этом рак молочной железы (РМЖ)
занимает первое место среди всех опухолевых процессов
в женской популяции [1]. Наряду с хирургическим лече-
нием и лучевой терапией применение противоопухоле-
вых лекарственных средств является одной из основных
стратегий лечения пациентов с этим заболеванием.
В последние годы был достигнут значительный
прогресс в области лекарственной терапии РМЖ, свя-
занный главным образом с применением средств мо-
лекулярно-направленной (таргетной) терапии, в част-
ности, у лиц с Her2/neu-позитивными вариантами
опухоли [2, 3]. При этом выявление тройного негативно-
го (ТН) молекулярного типа РМЖ, характеризующегося
отсутствием или гипоэкспрессией эстрогеновых и про-
гестероновых рецепторов, Her2/neu, Ki-57-негативно-
стью, сопряжено с крайне неблагоприятным прогнозом
в том числе вследствие ограничения эффективных тера-
певтических опций [4]. Это делает изыскание потенци-
альных мишеней и их лекарственных лигандов чрезвы-
чайно актуальной задачей онкофармакологии.
В недавно появившихся публикациях указыва-
ется на драйверное значение рецептора эпидермаль-
ного фактора роста (EGFR) в прогрессии ТН РМЖ [5]
и придается особое значение анти-EGFR фармаколо-
гическим агентам как средствам контроля канцеро-
генеза [6]. Специалистами из АО «Всесоюзный науч-
ный центр по безопасности биологически активных
веществ» в ходе широкого внеэкспериментального
скрининга новых молекул был выделен ряд веществ –
производных дигидроакридона – с высокой вероятно-
стью противоопухолевой активности [7]. В частности,
было установлено, что соединение 9-амино-3,3-диме-
тил-3,4-дигидроакридин-1 (2H)-он 2-гидроксисукци-
нат с лабораторным шифром ЛХТ-17-19 эффективно
подавляет рост ксенографтного рака мочевого пузы-
ря [7]. Идентификация и последующий синтез новых
соединений упомянутого класса сделали возможным
проведение их экспериментального исследования в мо-
дельных опухолевых системах и обусловили выполне-
ние настоящего исследования.
Цель исследования – определить особенности
реализации противоопухолевой активности нового
соединения дигидроакридона в модельных опухоле-
вых системах – органоидной и ксенографтной моделях
ЕGFR-позитивного ТН РМЖ.
Исследование проведено при неукоснительном
следовании положениям приказа Минздрава России
от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении принципов над-
лежащей лабораторной практики» и принципам гуман-
ного обращения с лабораторными животными. Про-
токол экспериментального исследования в 2022 г. был
рассмотрен и одобрен на заседании Локального этиче-
ского комитета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Се-
ченова Минздрава России (Сеченовский Университет).
В работе изучено оригинальное вещество – 3-пи-
ридинкарбамид 2-амино-5-метилпиридин (лаборатор-
ный шифр учреждения-разработчика – ЛХТ-13-19),
разработанное и полученное в АО «Всесоюзный науч-
ный центр по безопасности биологически активных
веществ» (г. Старая Купавна), в виде фармацевтической
субстанции с чистотой 99,8%. Раствор ЛХТ-13-19 для
инъекций, рабочий раствор для введения в среду куль-
тивирования готовили ex tempore растворением мел-
кокристаллического порошка в стерильном 0,9% изо-
тоническом растворе хорида натрия при нагревании
до 37 °С и постоянном помешивании.
Эксперименты выполнены в ex vivo и in vivo мо-
дельных системах: органоидной и ксенографтной моде-
лях ТН РМЖ. Ткань опухоли с подтвержденным имму-
ногистохимическим и молекулярным вариантом была
получена интраоперационно у пациентки 68 лет с била-
теральным поражением, не получавшей предшествую-
щего химиотерапевтического лечения и давшей добро-
вольное информированное согласие на использование
биологического материала в исследовательских целях
в онкологической клинике ФГАОУ ВО Первый МГМУ
им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский
Университет). Образец тканей опухоли механически
разделяли на мелкие кусочки с помощью микрохирур-
гических ножниц и незамедлительно помещали в рас-
твор для хранения тканей MACS (MilteNY Biotec, Герма-
ния). Образцы хранили при температуре 40 °С не более
8 часов. Затем образцы переносили в MACS C (MilteNY
Biotec, Германия) для гомогенизации тканей и далее
в смесь ферментов Tumor Dissociation Kit того же произ-
водителя для диссоциации клеток. Полученную суспен-
зию центрифугировали при 3000g в течение 10 минут.
Осадок разводили в 10 мл забуференного 0,9% изотони-
ческого раствора хлорида натрия и снова центрифуги-
ровали. Супернатант удаляли, а осадок разводили сре-
дой DMEM/F-12 (Thermo Fisher Scientific, США). Часть
клеток использовали для моделирования ксенографта,
оставшуюся часть смешивали с Matrigel (Corning, США)
в соотношении 1:2, 50 мкл смеси переносили в 24-луноч-
ный планшет (TPP, Швейцария) и инкубировали при
37 °С в атмосфере 5% CO2 в течение 20 минут. В каждую
лунку добавляли полную клеточную среду (750 мкл)
и повторяли цикл инкубации. Культуральную среду об-
новляли каждые 48 часов. Растущие органоиды наблю-
дали под микроскопом PrimoVert (Carl Zeiss, Германия).
Рекультивирование органоидов проводили раз в две не-
дели. Жизнеспособность органоидных клеток ТН РМЖ
на фоне семисуточного присутствия ЛХТ-13-19 оцени-
вали с использованием набора для анализа пролифера-
ции клеток CellTiter 96 Aqueous One Solution на основе
MTS (Promega, США) [8]. Раствор производного акриди-
на ежедневно добавляли в инкубационную среду в кон-
центрациях 0,5; 2,0; 9,0; 60,0; 250,0 и 1000,0 мкМ.
Ксенографтную модель ТН РМЖ воспроизводили
на 8–10-недельных мышах-самках линии NOD SCID, при-
обретенных в питомнике SPF-животных ФГБУН «Инсти-
тут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемя-
кина и Ю.А. Овчинникова» РАН. Животные содержались
в условиях естественного освещения при неограничен-
ном доступе к воде и корму в индивидуальных венти-
лируемых клетках. Моделирование экспериментальной
патологии проводили у наркотизированных изофлура-
ном (наркозная приставка RWD для грызунов, Китай)
животных, которым после удаления шерсти проводили
Y-образный грудно-паховый разрез, обнажали 4-й пахо-
вый жировой комок и вводили в него взвесь 2 × 106 опу-
холевых клеток в матригеле в объеме 30–40 мкл [9]. После
ушивания раны животные переводились в индивиду-
альные клетки. После того как опухоль достигала раз-
меров 150–180 мм3, животных разделяли на две группы
по 10 особей в каждой: контроль и группа ЛХТ-13-19.
Животным группы контроля вводили внутрибрюшинно
0,5 мл 0,9% изотонического раствора хлорида натрия, мы-
шам второй группы – 2 мг/кг ЛХТ-13-19 в течение 10 дней
однократно в сутки [10]. Наблюдение за животными осу-
ществляли ежедневно, опухоль измеряли, для вычисления
ее объема применяли формулу 1/6 × Д × Ш2, где Д – длина,
Ш – ширина опухолевого узла [9]. На 30-е сутки выжив-
ших животных выводили из эксперимента, подсчитыва-
ли поверхностные метастазы в легких и головном мозге.
На протяжении эксперимента контролировали болевой
синдром с помощью мимической шкалы [11]. Живот-
ным с умеренным и выраженным болевым синдромом
дважды в сутки внутрижелудочно вводили кетопрофен
в 2% крахмальном геле.
Органоидная система ТН РМЖ, экспрессирующая
EGFR, была разработана и морфологически валидирована
(рис. 1 А–В). Семидневная инкубация органоидной культуры
с 0,5–60,0 мкМ соединения дигидроакридона ЛХТ-13-19 сопро-
вождалась торможением роста органоидов на фоне их инкуба-
ции со всеми исследуемыми концентрациями соединения. Уве-
личение концентрации ЛХТ-13-19 до 250 и 1000 мкМ приводило
к существенному уменьшению размера органоидов за счет гибе-
ли опухолевых клеток (рис. 1 Г). Расчетный индекс подавления
роста органоидов (GI50) составил 16,24 мкМ (95% доверитель-
ный интервал (ДИ) 4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005).
Экспериментальное лечение мышей, несущих
мутантный генотип ксенотрансплантатной карцино-
мы молочной железы, экспрессирующей EGFR, привело
к снижению числа отдаленных метастазов в головной
мозг и легкие до 22,5 ± 3,4 против 88,6 ± 7,8 в контроль-
ной группе (p = 0,001) (рис. 2 А). Одновременно мы наблю-
дали значительное увеличение времени удвоения объема
опухоли (рис. 2 Б и В): время удвоения опухоли увеличи-
лось до 26,5 ± 4,4 суток в группе животных, получавших
ЛХТ-13-19, тогда как в контрольной группе среднее время
составляло 10,7 ± 2,7 суток (p = 0,005) (рис. 2 Б). Экспе-
риментальная терапия ЛХТ-13-19 также продлевала вы-
живаемость лабораторных мышей (рис. 2 Г), а медиана
времени выживания в экспериментальной группе соста-
вила 31 день против 25 дней в контрольной группе (лога-
рифмический критерий 5,441; р = 0,02).
При патоморфологическом исследовании ауто-
псийного материала после экспериментального ле-
чения ЛХТ-13-19 в остаточной опухоли наблюдалось
уменьшение количества опухолевых структур до 30%
просмотренных участков, с дистрофическими измене-
ниями клеток и очагами фиброза. Эти результаты со-
ответствуют III степени терапевтического патоморфоза
по классификации I.D. Miller и соавт. [10]. При иммуно-
гистохимическом анализе образцов не регистрировали
EGFR-позитивного окрашивания мембран клеток.
Обсуждение
Значительные достижения в области молекулярной
биологии рака и идентификация внутриклеточных путей
канцерогенной клеточной трансформации и прогрессиро-
вания стимулируют поиск перспективных лигандов, наце-
ленных на макромолекулы-драйверы. EGFR представляет
собой широко известную киназу, которая играет ключевую
роль во внутриклеточной метаболической регуляции при
многих видах рака. Ингибиторы киназы считаются эффек-
тивной основой стратегии лечения рака легких, поджелу-
дочной железы, молочной железы и др.
предыдущих работах установлено, что соедине-
ния дигидроакридона обладают антикиназной активно-
стью и способны сдерживать прогрессию злокачествен-
ных опухолей. В фокусе настоящего исследования было
оригинальное отечественное вещество с высоким про-
гностическим антибластомным потенциалом. В рамках
одного исследования нам хотелось изучить особенности
реализации противоопухолевого действия нового ве-
щества на двух видах опухолевых моделей, воспроиз-
водящих клеточно-тканевой и организменный уровни
организации живых систем. При этом выбор пал на ТН
РМЖ в силу того, что EGFR является одной из перспек-
тивных мишеней для потенциального таргетного воз-
действия [5].
Мы установили, что в органоидной системе
EGFR-экспрессирующего ТН РМЖ ЛХТ-13-19 не только
замедляет рост трехмерных опухолеподобных струк-
тур, но и приводит к сокращению их размера, что может
быть обусловлено как цитостатическим, так и цитоток-
сическим действием вещества. Очевидно, полученный
эффект не связан с ухудшением условий культивирова-
ния, поскольку в параллельных трехмерных культурах
пролиферация опухолевых клеток продолжалась.
На ксенографтной модели заболевания, воспро-
изведенной из того же, что и органоиды, исходного
опухолевого материала, регистрировали увеличение
продолжительности жизни мышей – носителей опу-
холи человека, получавших экспериментальное лече-
ние. Эффект был обусловлен замедлением опухолевой
прогрессии в виде торможения роста первичного узла
и ингибирования метастатической активности. Пред-
ставляет интерес, что при патоморфологическом иссле-
довании лекарственный патоморфоз, индуцированный
ЛХТ-13-19, был связан в первую очередь с элиминацией
EGFR-экспрессирующих опухолевых клеток, тогда как
EGFR-негативный клеточный субстрат опухоли сохра-
нялся. С этой селективностью, вероятно, связано отсут-
ствие случаев полной редукции опухолевого процесса.
Настоящее исследование не лишено недостат-
ков и ограничений: во-первых, было бы интересным
с точки зрения лекарственного контроля за эволюцией
опухоли изучить особенности активности ЛХТ-13-19
в моделях второй и третьей генерации. Во-вторых, для
подтверждения антикиназного действия нового веще-
ства можно было бы определить экспрессию гена EGFR
с определением мутационной нагрузки [5]. Понимая
важность упомянутых обстоятельств, мы планируем
осветить их в наших дальнейших работах.
Выводы
1. Инкубация трехмерной органоидной культуры
EGFR-экспрессирующего ТН РМЖ в присутствии
3-пиридинкарбамид 2-амино-5-метилпиридина
(лабораторный шифр ЛХТ-13-19) сопровождает-
ся зависимым от концентрации циторедуктив-
ным эффектом с GI50, равным 16,24 мкМ (95% ДИ
4,44–28,04 мкМ; R2 = −0,92; p = 0,005).
2. Введение мышам – носителям ксенографтного
ТН РМЖ ЛХТ-13-19 в дозе 2 мг/кг в сутки в те-
чение 10 дней увеличивало выживаемость ла-
бораторных животных до медианного значения
31 день против 25 дней в контрольной группе
(log rank = 5,441; р = 0,02) и сопровождалось тор-
можением роста опухоли и ее метастазирования.
3. Опухолевая циторедукция под действием
ЛХТ-13-19 была обусловлена селективным воз-
действием на EGFR-экспрессирующие опухоле-
вые клетки.
Исследование проведено при поддержке гранта
Российского научного фонда № 23-25-00097,
https://rscf.ru/project/23-25-00097.
Литература
1. Kern R., Correa S.C., Scandolara T.B. et al. Current advances
in the diagnosis and personalized treatment of breast
cancer: lessons from tumor biology. Per. Med. 2020; 17:
399–420.
2. Alexopoulos A., Karanikiotis C., Ardavanis A. et al. Safety
and efficacy of RAD001 (Everolimus) administered upon
relapse during or after adjuvant treatment in post-menopausal
women with hormone receptor positive,
HER2/neu negative locally advanced or metastatic breast
cancer (CRAD001JGR08 «MELPOMENI» study). Anticancer
Res. 2022; 42: 1031–1041.
3. Osborne C., Challagalla J.D., Eisenbeis C.F. et al. Ixabepilone
and carboplatin for Hormone Receptor Positive/
HER2-neu negative and triple negative metastatic breast
cancer. Clin. Breast Cancer. 2018; 18: e89–e95.
4. Schmid P., Cortes J., Dent R. et al. Event-free survival
with pembrolizumab in early triple-negative breast cancer.
N. Engl. J. Med. 2022; 386: 556–567.
5. Yin L., Duan J.J., Bian X.W., Yu S.C. Triple-negative breast
cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast
Cancer Res. 2020; 22: 61.
6. Lev S. Targeted therapy and drug resistance in triple-negative
breast cancer: the EGFR axis. Biochem. Soc. Trans.
2020; 48: 657–665.
7. Кудрявцев М.Ю., Дерябина О.Н., Самышина Е.А. и др.
К вопросу о противоопухолевой активности нового
соединения – производного пиридина. Вестник «Био-
медицина и Социология». 2021; 4: 52–59.
8. Nikulin S.V., Alekseev B.Y., Sergeeva N.S. et al. Breast cancer
organoid model allowed to reveal potentially beneficial
combinations of 3,3’-diindolylmethane and chemotherapy
drugs. Biochimie. 2020; 179: 217–227.
9. Fernando W., Coyle K.M., Marcato P. Breast cancer xenograft
murine models. Methods Mol. Biol. 2022; 2508:
31–44.
10. Miller I.D., Payne S., Ogston K.N. A new gistological grading
system to assess response of breast cancer to primary
chemotherapy. Int. J. Oncol. 2002; 20 (4): 791–796.
11. Langford D.J., Bailey A.L., Chanda M.L. et al. Coding of facial
expressions of pain in the laboratory mouse. Nat. Methods.
2010; 7: 447–449.
