ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ И ЕГО КОРРЕЛЯЦИЙ С КЛИНИЧЕСКИМИ И ЛАБОРАТОРНЫМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПОЧЕК
Стуров Н.В., Попов С.В., Беликов И.И. и др. Исследование состава кишечной микробиоты и его корреляций с клиническими и лабораторными показателями у пациентов с хронической болезнью почек. Фармакология & Фармакотерапия. 2023; 2: 38–43. DOI 10.46393/27132129_2023_2_38
Высокая распространенность хронической болезни почек (ХБП) и тяжесть сопутствующих заболеваний требуют разработки новых под- ходов к их раннему выявлению и лечению. В настоящее время активно изучается роль кишечной микробиоты (КМ) в развитии осложне- ний ХБП, однако объектом таких исследований является метаболом или отдельные уремические токсины. В настоящей работе исследован количественный и качественный состав КМ у пациентов с ХБП, проведен корреляционный и дисперсионный анализ между компонента- ми микробиоты кишечника и полом, возрастом, сопутствующими заболеваниями, гематологическими и биохимическими показателями крови, показателями мочи у данной категории больных. Выявлены корреляции между отдельными микроорганизмами с возрастом, по- лом, наличием артериальной гипертензии, уровнями калия крови, печеночных аминотрансфераз, эритроцитов, гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов мочи. Часть выявленных корреляций не обсуждалась ранее в литературе и требует подробного изучения.
Распространенность хронической болезни почек (ХБП) сопоставима с частотой артериальной гипертен- зии и сахарного диабета. Снижение функции почек на- блюдается у 16% лиц трудоспособного возраста и 36% лиц старше 60 лет [1]. Прогрессирование заболевания до терминальной хронической почечной недостаточности обусловливает необходимость заместительной почеч- ной терапии [2]. Таким образом, изучение прогностиче- ских факторов прогрессирования ХБП и ее осложнений, а также разработка новых диагностических и терапевти- ческих подходов в целях пролонгирования додиализно- го периода являются актуальной задачей нефрологии. Развитие технологий высокопроизводительного секвенирования и газовой хроматографии – масс-спек- трометрии (ГХ-МС) позволило изучать сложные ми- кробные сообщества в организме человека. Благодаря указанным технологиям были обнаружены микроор- ганизмы, которые не удавалось выявить стандартны- ми культуральными методами, в том числе в составе кишечной микробиоты (КМ) [3]. КМ представляет собой сообщество микроорганизмов, населяющих ки- шечник человека. Ряд проведенных в последние годы исследований позволил выявить изменения состава КМ у пациентов на разных стадиях ХБП и определить основные механизмы взаимодействий в системе «ки- шечник – почки». Были изучены механизмы гидро- лиза мочевины до аммиака, который является одним из ключевых агентов в повышении проницаемости ки- шечной стенки. Также был определен ряд доказанных и потенциальных уремических токсинов, источником которых является КМ [3]. Несмотря на достигнутый прогресс в области изучения КМ, вопрос о связи между микробиотой и биохимическими параметрами крови пациента изу- чен недостаточно. Проведенные к настоящему времени работы фокусировались на оценке всего метаболома крови или конкретных, хорошо известных токсинов. Изучение метаболома в разрезе изменений КМ пре- доставляет информацию об изменении концентраций отдельных молекул (например, метаболитов аминокис- лот, разветвленных жирных кислот и пуринов), однако мониторинг данных метаболитов экономически недо- ступен в рутинной клинической практике, а его зна- чимость для раннего выявления осложнений не ясна. Вопрос о связи КМ и гематологических параметров изучался в основном в контексте маркеров воспале- ния [4]. Связь между изменением состава КМ и развити- ем сопутствующих заболеваний или осложнений была изучена в ряде работ, однако необходимо отметить сле- дующее: микробиота человека является сложноустро- енным сообществом, структура которого формируется разнообразными факторами организма и окружающей среды. Исследователи отмечают, что генетические фак- торы человека, диета, уровень и характер физической активности, спектр химических веществ из окружающей среды, с которыми ежедневно контактируют пациенты, существенно отличаются. Вследствие этого, несмотря на наличие работ по данному вопросу, воспроизведение исследований на популяциях российских пациентов яв- ляется целесообразным и актуальным [5]. Целью нашей работы было изучение изменения состава КМ у пациентов с ХБП и взаимосвязей между отдельными таксонами микроорганизмов с возрастом, полом, сопутствующими заболеваниями, а также пока- зателями анализов крови и мочи. Материал и методы Отбор участников опытных групп проводился на базах ЧУЗ «Клиническая больница “РЖД-Медици- на” им. Н.А. Семашко», амбулаторно-поликлинического центра РУДН. В основную группу были набраны 50 па- циентов с ХБП, в группу контроля – 26 здоровых добро- вольцев. Критериями включения в основную группу (пациенты c ХБП) были возраст старше 18 лет, стадия ХБП С2А1–С4А3, в группу контроля – возраст стар- ше 18 лет. Критерии исключения: в основной груп- пе – возраст младше 18 лет, отсутствие добровольного информированного согласия, диализное лечение, в кон- трольной группе – наличие ХБП, сахарного диабета, вос- палительных заболеваний печени. Исследование было проведено с 1 марта 2021 г. по 30 ноября 2022 г. Для исследования состава КМ проводился ана- лиз фекальной микробиоты с помощью высокочувстви- тельного и селективного метода ГХ-МС. Это современ- ная аналитическая технология, имеющая разрешение Росздравнадзора на применение в качестве новой меди- цинской технологии «оценки микроэкологического ста- туса человека методом хромато-масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010). Данный метод основан на вы- сокоточном количественном определении микробных маркеров, входящих в состав клеточных стенок, из числа высших жирных кислот микроорганизмов и позволяет одновременно измерять концентрации ряда микробных маркеров в анализируемом материале без использова- ния специальных питательных сред. Общий клинический и биохимический анализы крови, мочи проводили стандартными методами клини- ческой лабораторной диагностики. Все данные были занесены в обезличенном виде в программу Microsoft Excel Office 365. В целях повыше- ния достоверности результатов сбор данных, их внесе- ние и статистический анализ проводились разными ав- торами. Статистический анализ выполнен в программе Statsosft Statistica 13.0 c расчетом критерия Манна–Уит- ни, t-критерия Стьюдента, проводился дисперсионный и корреляционный анализ. Результаты В результате проведенного исследования дана комплексная характеристика структуры КМ у пациен- тов с ХБП (рис. 1). Как видно на графике, преобладающими бактери- ями в группе ХБП являлись Streptomyces spp., Clostridium spp. (группа C. tetani), Prevotella spp., Eubacterium spp., Streptococcus mutans, Aspergillus spp., Propionibacterium spp., Propionibacterium freudenreichii. При сравнении основной и контрольной групп по результатам статистического анализа с исполь- зованием U-критерия Манна–Уитни установлены значимые различия в численности следующих ми- кроорганизмов: Clostridium propionicum, Eubacterium spp., Ruminococcus spp., Propionibacterium jensenii, Eggerthella lenta, Bacillus cereus, Actinomyces spp., Herpes spp., суммы микроорганизмов, суммы маркеров ви- русов, Streptococcus mutans, Clostridium hystolyticum/ Streptococcus рneumoniaе, Nocardia asteroides, Kingella spp. (все p < 0,05). Наибольшая достоверность различий ос- новной и контрольной групп приходится на сле- дующие категории микроорганизмов: Clostridium propionicum, Propionibacterium jensenii, Ruminоcoccus spp., Bacillus cereus, Herpes spp., Clostridium hystolyticum/Streptococcus pneumoniae, Eubacterium spp., которые в контрольной группе имеют большее количественное выражение, чем в группе пациентов с ХБП (рис. 2). Большее зна- чение Clostridium propionicum, Propionibacterium jensenii, Ruminоcoccus spp., Eubacterium spp. в контрольной группе, возможно, обусловлено продукцией короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) и их свойствами. КЦЖК, в свою оче- редь, обладают противовоспалительным, проти- воопухолевым действием, защищают организм от патогенов и токсинов, стимулируя развитие нормальной микрофлоры, то есть поддерживают микробное равновесие и целостность слизистой кишечника. При проведении дисперсионного анализа (кри- терий Фишера) выявлены достоверные связи коли- чества плазмологена, Alcaligenes spp./Klebsiella spp. со стадиями ХБП С3БА2 и С4А3, Flavobacterium spp., Helicobacter pylori, Rhodococcus spp., Staphylococcus epidermidis – со стадией С3БА2, Propionibacterium freudenreichii – со стадией С4А3. По результатам корреляционного анализа было установлено, что с увеличением возраста количествен- но уменьшаются Clostridium hystolyticum/Streptococcus pneumoniae, Actinomyces spp., Herpes spp. (обратная средняя зависимость -0,36; -0,30; -0,38 соответствен- но), с увеличением индекса массы тела – Eubacterium spp., Propionibacterium spp., сумма микроорганизмов (обратная средняя зависимость -0,42; -0,35; -0,31 соот- ветственно). В ходе исследования выявлена статистически значимая связь Propionibacterium spp. с женским полом (p < 0,05). Определено, что данный вид микроорганиз- мов достоверно чаще встречается именно у женщин при ХБП (p < 0,05). При проведении дисперсионного анализа по критерию Фишера также было выявлено достовер- ное влияние степени и стадии гипертонической болез- ни (ГБ) на количественную характеристику бактерий. Bacillus cereus, Streptococcus spp., Propionibacterium acnes, Streptomyces spp., Flavobacterium spp., Propionibacterium spp. чаще выявлялись у пациентов с ГБ 2-й степени (р < 0,06). Clostridium propionicum чаще встречалась у па- циентов с ГБ II стадии. У пациентов с ХБП при анемии достоверно чаще встречались Bacillus megaterium, Propionibacterium freudenreichii, Rhodococcus spp., Helicobacter pylori, Alcaligenes spp./Klebsiella spp., Candida spp. По результатам дисперсионного анализа по кри- терию Фишера, у пациентов с хроническим пиелонеф- ритом и хроническим гломерулонефритом достоверно чаще встречалась Nocardia asteroides. После всестороннего анализа структуры КМ проводилось исследование корреляций с ге- матологическими и биохимическими анализами крови. У пациентов основной группы выявлены корреляционные связи Streptococcus mutans (0,86), Lactobacillus spp. (0,88), Eubacterium spp. (0,61) с уровнем калия крови. Так как пациенты с ХБП склонны к развитию гиперкалиемии и получают диету с пониженным содержанием калия, проведе- но сравнение показателей у больных, находящихся на гипокалиемической диете и не использующих таковую. Статистический анализ не показал досто- верных корреляционных связей между уровнями калия и указанными бактериями между подгруп- пами. Выявлены также корреляционные зависи- мости между составом КМ и уровнем печеночных аминотрансфераз. Дальнейший анализ по этим параметрам проводился после разделения паци- ентов на когорты в соответствии со стадией ХБП. Для 16 пациентов с ХБП стадии С2 выявлены ста- тистически значимые корреляционные связи меж- ду уровнем аспартатаминотрансферазы (АСТ) и Clostridium propionicum (0,52). Для 30 пациентов с ХБП стадии С3 выявлены статистически значи- мые корреляционные связи между уровнем АСТ и Streptococcus spp. (0,58), Clostridium spp. (груп- па C. tetani) (0,52), Pseudomonas aeruginosa (0,37); уровнем аланинаминотрансферазы и Streptococcus spp. (0,59), Clostridium spp. (группа C. tetani) (0,65), Clostridium perfringens (0,39), Nocardia spp. (0,38), Pseudomonas aeruginosa (0,54). Так как у ряда па- циентов течение ХБП осложняется неалкогольной жировой болезнью печени [6], мы провели сравне- ние значимости корреляционных связей у пациен- тов с гепатозом и без такового как внутри каждой стадии ХБП, так и в основной группе в целом. Ста- тистический анализ по критерию Манна–Уитни не показал достоверных корреляционных связей между наличием жирового гепатоза, количеством указанных бактерий и показателями аминотранс- фераз. Обнаружена достоверная корреляционная за- висимость уровня триглицеридов с Clostridium hystolyticum/ Streptococcus pneumoniae (0,52). Выявлено, что с повышением количества триглицеридов увеличива- ется количество Clostridium hystolyticum/Streptococcus pneumoniae. В общем анализе крови для всех пациен- тов установлены корреляционные связи уровня эритроцитов крови и Nocardia asteroides (-0,45), Propionibacterium freudenreichii (-0,51), Alcaligenes spp./Klebsiella spp. (-0,44). Также отмечены кор- реляционные связи между уровнем гемоглобина и Candida spp. (-0,44), Bifidobacterium spp. (-0,42). С лейкоцитами крови обнаружена прямая связь Actinomyces spp. (0,62). Проводилось также исследование корреляций бактерий в КМ с показателями общего анализа мочи у пациентов с ХБП. У пациентов с наличием Bacillus cereus, Propionibacterium jensenii выявлено увеличение числа лейкоцитов в моче (прямая корреляция соответ- ственно 0,59; 0,45). У пациентов с Streptococcus mutans обнаружено повышение количества эритроцитов в моче (прямая корреляция 0,46). Обсуждение Изменения количественного состава КМ, об- наруженные в настоящем исследовании, отличаются от результатов, представленных в аналогичных рабо- тах [4, 7, 8]. Данные отличия подчеркивают необходи- мость репродукции исследований по изучению состава КМ в различных популяциях. Известно, что гиперкалиемия является частым осложнением ХБП, приводящим к нарушениям сер- дечного ритма и, как следствие, неблагоприятным сердечно-сосудистым событиям [9]. Употребление продуктов с пониженным содержанием калия ре- комендовано пациентам с ХБП и, по данным ряда исследований, за счет снижения потребляемых пи- щевых волокон оказывает отрицательное влияние на количество сахаролитических бактерий в просве- те кишечника [3]. Отсутствие достоверных различий между пациентами, соблюдающими гипокалиемиче- скую диету и не придерживающимися ее, указывает на то, что корреляционная связь между уровнями ка- лия и составом КМ обусловлена другими факторами. Исследования, проведенные на Streptococcus mutans, показывают, что для данной бактерии калий является критически важным элементом для персистирования в ротовой полости. Штаммы Streptococcus mutans, де- фектные по транспортеру Trk2, демонстрируют замед- ленный рост и снижение способности к образованию биопленки [10]. Мы предполагаем, что повышение уровня бактерии является следствием гиперкалиемии, а не ее причиной. Напротив, данные по Lactobacillus rhamnosus показывают, что данный микроорганизм способен влиять на потенциал действия как нейронов кишечника [11], так и тучных клеток [12] путем ин- гибирования кальций-зависимых калиевых каналов. При этом важно отметить, что роль данных каналов в патогенезе гиперкалиемии ХБП не была изучена, как и механизмы подобного действия. Рядом исследователей показано повыше- ние уровней Streptococcus spp., Enterobacteriaceae и Clostridium spp. в КМ у пациентов с заболеваниями печени, такими как алкогольный гепатоз или цирроз, вызванный вирусом гепатита В [13, 14]. А. Tsuruya и соавт. предполагают, что указанные изменения вы- званы большим количеством активных форм кисло- рода (АФК), обусловленных хроническим употребле- нием алкоголя [15]. Однако у пациентов с циррозом и повышенными уровнями печеночных аминотранс- фераз изменения КМ являются следствием упо- требления алкоголя, в то время как в исследуемых нами группах употребление алкоголя не было стати- стически значимым. У пациентов с ХБП наблюдается повышенное образование АФК [16], что может объяс- нить выявленные изменения КМ. Представляет интерес обнаружение отри- цательных связей средней силы между Nocardia asteroides и количеством эритроцитов крови, так как данный микроорганизм до недавнего времени описы- вался в литературе исключительно как сапрофитная бактерия, редко вызывающая инфекции у пожилых лиц и пациентов с иммуносупрессией. В то же вре- мя в настоящем исследовании, а также ряде недав- них публикаций Nocardia spp. являлась распростра- ненным компонентом КМ, что, возможно, потребует смены представлений об экологии данной бактерии. В недавнем исследовании состава КМ у пациентов с хронической сердечной недостаточностью были выявлены отрицательные связи между представлен- ностью Nocardia asteroides и уровнями интерлейкинов 6 и 10 [17]. При этом данные цитокины положитель- но коррелируют с тяжестью почечной анемии [18], в связи с чем интересно рассмотреть нецитокино- вые механизмы влияния нокардий на эритропоэз. Propionibacterium freudenreichii широко применяется в промышленности для производства швейцарских сыров, а также входит в состав пробиотиков, пока- завших умеренную эффективность при синдроме раздраженного кишечника [19]. Candida spp. нередко выявляется в ротовой полости у пациентов с хрони- ческими заболеваниями и дентальными патологиями, однако роль данного микроорганизма в КМ изучена недостаточно. Bifidobacterium spp. является хорошо изученным компонентом пробиотиков, положитель- но влияющим на течение железодефицитной анемии [20], в связи с чем обнаружение отрицательных корре- ляционных связей требует подробного изучения. Ряд обнаруженных нами корреляционных зави- симостей между составом КМ и наличием сопутствую- щей ГБ разных стадий был отмечен в других исследова- ниях [21–23], в то время как корреляционные связи для Flavobacterium spp. и Propionibacterium spp. были пока- заны в настоящей работе впервые. В литературе описан спектр механизмов влияния компонентов КМ на разви- тие артериальной гипертензии, включая изменение кон- центраций бутиратов, провоспалительных цитокинов, триметиламмоний-N-оксида и вторичных желчных кис- лот [23]. Заключение В настоящем исследовании впервые на популя- ции российских пациентов с ХБП изучены корреляци- онные зависимости между клиническими данными, показателями лабораторных анализов крови, мочи и изменениями качественного и количественного состава КМ. Часть обнаруженных корреляций не ос- вещалась ранее в литературе и требует дальнейше- го более подробного изучения. Полученные данные, возможно, дополнят сведения о роли КМ в развитии ХБП, что позволит улучшить результаты ее диагнос- тики и своевременного лечения. Литература 1. Ассоциация нефрологов. Клинические рекомендации «Хроническая болезнь почек (ХБП)». М.: Министер- ство здравоохранения Российской Федерации, 2021. 233 c. 2. Перлин Д.В. Тактика почечно-заместительной терапии в регионах России со средней плотностью населения. Вестник урологии. 2019; 7 (4): 53–68. 3. Krukowski H., Valkenburg S., Madella A.-M. et al. Gut microbiome studies in CKD: opportunities, pitfalls and therapeutic potential. Nat. Rev. Nephrol. 2023; 19 (2): 87–101. 4. Барилко М., Селивестров П., Радченко В. Дисбиоз толстой кишки и хроническая болезнь почек. Врач. 2019; 30 (2): 14–19. 5. Лукичев Б., Румянцев А., Акименко В. Микробиота кишечника и хроническая болезнь почек. Сообщение первое. Нефрология. 2018; 22 (4): 57–73. 6. Latiwesh O.B., Younis M.Y.G., Srikumar S., Nouh F. Hepatic enzymes changes in chronic kidney disease patients – a need for modified reference values. J. Evol. Med. Dent. Sci. 2018; 7 (16): 1949–1954. 7. Vaziri N.D., Wong J., Pahl M. et al. Chronic kidney disease alters intestinal microbial flora. Kidney Int. 2013; 83 (2): 308–315. 8. Lun H., Yang W., Zhao S. et al. Altered gut microbiota and microbial biomarkers associated with chronic kidney disease. Microbiologyopen. 2019; 8 (4): e00678. 9. Arnold R., Pianta T.J., Pussell B.A. et al. Potassium control in chronic kidney disease: implications for neuromuscular function. Intern. Med. J. 2019; 49 (7): 817–825. 10. Binepal G., Gill K., Crowley P. et al. Trk2 potassium transport system in streptococcus mutans and its role in potassium homeostasis, biofilm formation, and stress tolerance. J. Bacteriol. 2016; 198 (7): 1087–1100. 11. Kunze W.A., Mao Y.-K., Wang B. et al. Lactobacillus reuteri enhances excitability of colonic AH neurons by inhibiting calcium-dependent potassium channel opening. J. Cell. Mol. Med. 2009; 13 (8B): 2261–2270. 12. Forsythe P., Wang B., Khambati I., Kunze W.A. Systemic effects of ingested Lactobacillus rhamnosus: inhibition of mast cell membrane potassium (IKCa) current and degranulation. PLoS One. 2012; 7 (7): e41234. 13. Zhong X., Cui P., Jiang J. et al. Streptococcus, the predominant bacterium to predict the severity of liver injury in alcoholic liver disease. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2021; 11: 649060. 14. Chen Y., Yang F., Lu H. et al. Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis. Hepatology. 2011; 54 (2): 562–572. 15. Tsuruya A., Kuwahara A., Saito Y. et al. Ecophysiological consequences of alcoholism on human gut microbiota: implications for ethanol-related pathogenesis of colon cancer. Sci. Rep. 2016; 6: 27923. 16. Irazabal M.V., Torres V.E. Reactive oxygen species and redox signaling in chronic kidney disease. Cells. 2020; 9 (6): 1342. 17. Vlasov A.A., Salikova S.P., Grinevich V.B. et al. Gut microbiota and systemic inflammation in patients with chronic heart failure. Kardiologiia. 2020; 60 (5): 859. 18. Keithi-Reddy S.R., Addabbo F., Patel T.V. et al. Association of anemia and erythropoiesis stimulating agents with inflammatory biomarkers in chronic kidney disease. Kidney Int. 2008; 74 (6): 782–790. 19. Cousin F.J., Mater D.D.G., Foligné B., Jan G. Dairy propionibacteria as human probiotics: a review of recent evidence. Dairy Sci. Technol. 2011; 91 (1): 1–26. 20. Zakrzewska Z., Zawartka A., Schab M. et al. Prebiotics, probiotics, and postbiotics in the prevention and treatment of anemia. Microorganisms. 2022; 10 (7): 1330. 21. Feng Y.L., Cao G., Chen D.-Q. et al. Microbiome-metabolomics reveals gut microbiota associated with glycine-conjugated metabolites and polyamine metabolism in chronic kidney disease. Cell. Mol. Life Sci. 2019; 76 (24): 4961– 4978. 22. Yang T., Richards E.M., Pepine C.J., Raizada M.K. The gut microbiota and the brain-gut-kidney axis in hypertension and chronic kidney disease. Nat. Rev. Nephrol. 2018; 14 (7): 442–456. 23. Martín Giménez V.M., Rukavina Mikusic N.L., Lee H.J. et al. Physiopathological mechanisms involved in the development of hypertension associated with gut dysbiosis and the effect of nutritional/pharmacological interventions. Biochem. Pharmacol. 2022; 204: 115213.